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血管内皮生长因子(VEGF)是一类具有多种生物活性的功能性糖蛋白,在骨骼生长发育过程中的血管生成、基质降解、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞的分化和功能活性调节等方面具有重要作用。本文旨在克隆、表达鸡VEGF基因,并在获得其活性蛋白的基础上,观察它对福美双诱发的肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)、肝肾抗氧化功能、血液生化指标以及软骨内成骨相关基因表达的影响,为阐明禽类TD的发病机理提供理论依据和重要启示。试验Ⅰ 鸡VEGF (chVEGF)基因的原核表达、纯化及抗体制备根据GenBank收录的鸡VEGF序列(AY168004)设计特异性引物,利用RT-PCR方法从鸡胫骨生长板总RNA中扩增得到VEGF基因,并将PCR产物克隆至pMD18-T载体。测序鉴定正确后,将chVEGF片段亚克隆至带有组氨酸标签的原核表达载体pET-32a(+)。再将重组质粒pET-32a(+)-chVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,实现chVEGF的有效表达。SDS-PAGE结果表明,得到的原核表达产物是大小约为38 kD的融合蛋白。Western blotting分析显示,表达的chVEGF蛋白能够与组氨酸抗体和山羊抗人VEGF多克隆抗体结合,具有良好的免疫反应性。通过镍离子亲和层析纯化原核表达的融合蛋白,以纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA结果显示该抗体效价达到1：10240。试验Ⅱ 鸡VEGF (chVEGF)在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定设计一对引物,在两引物的5’端分别插入EcoR I和Xba I酶切位点,从保存的重组质粒载体pMD18-T-VEGF上亚克隆得到鸡VEGF基因片段,该片段长576 bp,编码192个氨基酸残基。将其亚克隆至酵母表达载体pPICZa-A,重组阳性质粒以电穿孔法转化毕赤酵母X-33菌株,用Zeocin平板筛选重组子。将PCR鉴定的高拷贝菌株用甲醇诱导培养72 h,菌液离心取上清,用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析。结果显示,鸡VEGF在毕赤酵母系统中的表达产物有两种,其相对分子量分别为约46 kD和70 kD,两者均可被山羊抗人VEGF抗体和先期制备的鸡VEGF抗体识别,具备良好的抗原活性。经过初步处理的酵母表达VEGF蛋白作用于鸡胚绒毛尿囊膜,能够明显刺激其血管的生成,具有生物学活性。试验Ⅲ福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良模型的建立及其机理120羽1日龄AA肉仔鸡预饲一周后随机分为4组,从8日龄起分别给予基础日粮(对照组),福美双日粮(基础日粮+福美双100 mg·kg-1),福美双低铜日粮(基础日粮+福美双100 mg·kg-1 +CuSO4·5H2O 50 mg·kg-1),福美双高铜日粮(基础日粮+福美双100 mg·kg-1 +CuSO4·5H2O 100 mg·kg-1),试验期至21日龄。结果表明：(1)福美双能够诱发21日龄肉鸡典型的TD,显著增加TD发生率及严重程度,降低肉鸡生长速度和胫骨长度,提高血清Ca、P、ALP、SGOT的水平,与对照组相比,差异显著(P<0.05),但对血清SGPT水平和胫骨重并无明显影响；日粮中添加铜能抑制福美双对肉鸡TD和生产性能的影响,两者之间存在明显的互作关系；(2)福美双提高了肉鸡肝、心脏、胰腺中的铜水平,降低了肾组织中的铜含量,福美双日粮组与对照组相比,差异显著(P<0.05)；在肉鸡日粮中添加铜能降低福美双引起的肝铜水平增加,提高肾铜的含量,福美双低铜、高铜日粮组与福美双日粮组相比,差异显著(P<0.05)。(3)福美双诱导的肉鸡TD生长板上,血管通道稀少或闭塞,内皮细胞和损伤中心的软骨细胞大量死亡,增值区软骨细胞排列紊乱,柱状结构消失,未完全肥大的过渡性软骨细胞大量积聚形成异常软骨。结论：福美双是一种有效的TD诱导剂,可用于建立TD模型；损伤肉鸡肝、肾功能,影响Ca、P代谢和铜在机体不同组织的分布利用以及阻止血管形成和侵入生长板可能是福美双诱导TD发生的重要作用途径之一。试验Ⅳ鸡VEGF酵母表达产物对肉鸡TD、肝肾抗氧化功能和血液相关生化指标的影响240羽1日龄AA肉仔鸡在预饲一周后随机分为8组,每组30羽。A组为基础日粮对照组,E组为福美双日粮对照组,B、C、D组为基础日粮试验组,F、G、H组为福美双日粮试验组。在基础日粮中短期(8至14日龄)添加福美双(100 mg·kg-1)诱导TD发生。从9日龄起,A、E两组外的肉鸡均通过腿部肌肉注射分别给予3个不同剂量(10μg·kg-1,30 μg·kg-1、50 μg·kg-1)的酵母表达鸡VEGF蛋白,每4日一次,试验至21日龄。结果表明：(1)短期添加福美双显著增加了肉鸡TD的发生率和TD指数,明显提高各日龄肉鸡血清中P、ALP、StrACP的水平,显著降低15日龄肉鸡血清Ca的水平但明显提高21日龄肉鸡血清中Ca的水平(P<0.05)；(2)重组VEGF蛋白显著提高15日龄各试验组肉鸡血清Ca、P、ALP和StrACP的水平,与各自对照组相比,均差异显著(P<0.05),1；明显降低21日龄福美双组肉鸡血清Ca、P、StrACP水平但显著提高血清Ca水平,各试验组与福美双对照组相比,差异显著(P<0.05)；(3)重组VEGF蛋白对肉鸡的生长速度和TD发生率无明显影响,但显著降低福美双诱发的TD损伤严重程度,各福美双试验组与其对照组相比,均差异显著(P<0.05)；(4)注射中、低剂量的鸡VEGF蛋白显著提高肉鸡肝、肾组织中T-AOC、SOD、GSH-Px的水平,各试验组与其对照组相比,差异显著(P<0.05)；高剂量的VEGF重组蛋白会损伤肉鸡肝和肾的抗氧化能力。结论：修复肝肾损伤增强其抗氧化能力,影响矿物质和维生素等物质在机体内的代谢,间接或直接调节软骨内骨化相关细胞的功能,可能是VEGF在禽类TD病理发生过程中的重要作用之一试验V鸡VEGF酵母表达产物在TD损伤形成和修复期对软骨内成骨相关基因表达的影响试验动物的分组、饲养同试验Ⅳ。为研究鸡VEGF酵母表达产物在TD损伤形成和修复期对软骨内成骨相关基因表达的影响,在肉鸡15、21日龄时每组分别取5羽断颈处死后采集胫骨近端生长板,通过实时荧光定量PCR检测生长板软骨中Bcl-2、X型胶原、MMP-13、Runx2 mRNA水平的变化。结果显示：(1)短期添加福美双显著上调TD损伤形成期肉鸡胫骨生长板上编码Bcl-2、X型胶原基因的表达,显著下调MMP-13、Runx2基因的表达(P<0.05)；在TD损伤修复期,显著下调Bcl-2、X型胶原和Runx2基因的表达(P<0.05),但对MMP-13基因的表达没有影响；(2)重组鸡VEGF蛋白在TD损伤形成期显著上调生长板软骨中MMP-13、Runx2基因的表达(P<0.05),只在低剂量时上调Bcl-2和X胶原基因的表达；在TD损伤修复期,该重组蛋白则显著上调胫骨生长板上X型胶原、MMP-13、Runx2基因的表达,同时以剂量依赖性的方式下调Bcl-2基因的表达。结论：MMP-13、Runx2可能在TD病理发生中具有重要作用；外源VEGF蛋白可通过调节软骨内成骨关键基因的表达,抑制TD损伤的形成促进TD损伤软骨细胞功能的恢复,TD的发生可能与生长板上VEGF基因的异常表达和作用有关。