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痤疮(acne)是累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病,好发于头面部、颈部和胸背部,表现为黑头粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿等。免疫功能异常参与痤疮的发生、发展与转归。针对痤疮临床常见风热、湿热证候,玉凝膏由防风散(明代《普济方》)衍生而来,为地乌、荆芥穗、防风、白鲜皮、苦参五味中药制成的软膏剂,具有祛风、除湿的功效。本研究建立小鼠痤疮模型,观察玉凝膏防治痤疮的免疫药效,并初步探索其免疫药理机制。实验一小鼠痤疮模型的建立目的:以C57小鼠背部为造模部位,以油酸诱导,建立痤疮模型。方法:C57小鼠20只,随机分为对照组和9梯度浓度油酸造模组,每组2只;实验前1天剃除背部2cm×2cm范围毛发。对照组:100%液体石蜡每天涂抹60μl,连续21天。造模组:9梯度浓度油酸(25.5%～100.0%,k=0.85)每天涂抹60μl,连续21天。d22,处死动物,取背部皮肤,石蜡切片,HE染色,观察病理变化,形态计量毛囊角化体积比。Graphpad Prism 5软件非线型可变斜率回归,计算油酸诱发小鼠痤疮的半数有效浓度(EC50)。结果:随着油酸剂量升高,病变逐渐加重;油酸诱导小鼠的EC50为65%,95%信区间为42.07～99.74%,量效方程为 Y=0.09+0.84/[1+10(26.93-14.87x)],R=0.98。结论:确定了油酸诱导小鼠痤疮的造模剂量,成功建立痤疮模型。实验二 玉凝膏及其拆方防治痤疮的量效目的:确定玉凝膏及其拆方防治油酸诱导小鼠痤疮的量效。方法:C57小鼠120只,分为对照组与造模组。对照组背部2cm×2cm范围每天涂抹100%液体石蜡,连续21天。造模组背部2cm×2cm范围每天涂抹65%油酸,连续21天。d22,造模成功小鼠随机分为22组:模型组,7剂量地乌单药组(1.06～1060.23mg·kg-1·d-1,k=3.16),7剂量玉凝膏去地乌组(4.7～1767.1 mg·kg-1·d-1,k=3.16)、7剂量玉凝膏组(2.8～2827.3 mg·kg·-1·d-1,k=3.16)。对照组与模型组涂抹基质,治疗组分涂抹相应剂量药物,每天1次,连续14天。d35,末次给药4h后,水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,灌注固定,取背部皮肤。酶联免疫吸附法检测血清IL-1、IL-6和TNF-α含量。皮肤石蜡切片,HE染色观察病理变化,形态计量毛囊皮脂腺直径及毛囊角化体积构成比;Masson染色形态计量皮肤胶原纤维构成比。Prism-5.01软件非线型可变斜率回归分别计算不同药物的半数有效剂量(ED50)。结果:各给药组防治痤疮呈剂量依赖趋势,量效曲线呈“S“,型同玉凝膏组比较,地乌组与玉凝膏去地乌组量效曲线分别右移。以地乌用量剂量为标志进行回归,对毛囊导管角化、皮脂腺肥大、和胶原纤维的改善作用,玉凝膏组ED50为单药地乌组的0.14、0.28与0.10倍;对IL-1,IL-6与TNF-αα分泌的作用,玉凝膏组ED50分别为单药地乌组的0.49、0.15与0.20倍。以去地乌的方剂用量为标志进行回归,对毛囊导管角化、皮脂腺肥大、和胶原纤维的改善作用,玉凝膏组ED50分别为玉凝膏去地乌组的0.18、0.47与0.20倍;对IL-1,IL-6与TNF-α分泌的作用,玉凝膏组EED50分别为玉凝膏去地乌组的0.63,0.20与0.52倍。结论:玉凝膏及其拆方防治痤疮具有剂量依赖趋势,玉凝膏疗效最优,地乌有配伍增效的作用。实验三玉凝膏防治痤疮的免疫药效目的:观察玉凝膏防治小鼠痤疮的免疫药效。方法:C57小鼠96只,分为对照组与造模组。对照组背部2cm×2cm范围每天涂抹100%液体石蜡,连续21天。造模组背部2cm×2cm范围每天涂抹65%油酸,连续21天。d22,造模成功小鼠按体重给予均衡随机分为7组:模型组(Model)、异维A酸组(ATRA,60mg·kg-1·dd-1)、他克莫司组(TAC,60mg·kg-1·d-1)、地乌组(DW,60 mg·kg-1·d1)、玉凝膏低剂量组(YNL,60 mg·kg-1·d-1)、玉凝膏中剂量组(YNM,60 mg·kg-1dd1-)、玉凝膏高剂量组(YNH,60 mg·kg-1·dd1),每天背部涂抹给药,观察记录背部皮损状况,d36处死小鼠。HE染色观察小鼠背部痤疮皮损,形态计量毛囊角化体积比及毛囊皮脂腺直径;masson染色形态计量皮肤毛囊单位胶原纤维构成比;Elisa检测血清中IL-1、IL-6和TNF-αα含量。结果:与对照组比较,模型组小鼠毛囊角化显著增高(P<0.01),皮脂腺肥大(P<0.01),皮脂腺周围胶原纤维沉积增多(P<0.05),血清IL-1(P<0.01)、IL-6(P<0.01)和TNF-αα(P<0.01)含量显著升高。与模型组比较,阳性药异维A酸组与他克莫司组均显著改善小鼠毛囊角化显著降低(P<0.05),皮脂腺肥大减轻(P<0.05),皮脂腺周围胶原纤维沉积减少(P<0.05),血清 IL-1(P<0.05)、IL-6(P<0.05)和 TNF-α(P<0.05)含量显著降低;与阳性药异维A酸组与他克莫司组比较,玉凝膏低、中、高剂量组均显著改善小鼠毛囊角化显著降低(P<0.01),皮脂腺肥大减轻(P<0.05),皮脂腺周围胶原纤维沉积减少(P<0.05),血清 IL-1(P<0.01)、IL-6(P<0.05)和 TNF-α(P<0.05)含量显著降低。结论:玉凝膏通过缓解毛囊角化,减轻皮脂腺肥大,减少毛囊单位胶原纤维沉积以促进脂质排出;显著降低血清当中的炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α含量。实验四玉凝膏防治痤疮的免疫药理机制目的:初步探索玉凝膏防治小鼠痤疮的免疫药理机制。方法:C57小鼠120只,分为对照组与造模组。对照组背部2cm×2cm范围每天涂抹100%液体石蜡,连续21天。造模组背部2cm×2cm范围每天涂抹65%油酸,连续21天。d22,造模成功小鼠按体重给予均衡随机分为7组:模型组(Model)、异维A酸组(ATRA,60 mg·kg-1·d-1)、他克莫司组(TAC,60mg·kg-1dd1)、地乌组(DW,60mg·kg-1·d-1)、玉凝膏低剂量组(YNL,60mg·kg-1·d-1)、玉凝膏中剂量组(YNM,60mg·kg-1·dd1)、玉凝膏高剂量组(YNH,60mg·kg-1·d-1),每天背部涂抹给药,观察记录背部皮损状况,d36处死小鼠;取背部皮损组织,免疫组化、western blot检测皮肤组织中IL-1β3、TNF-α和JNK的表达水平。结果:玉凝膏下调IL-1(3、TNF-α和JNK的原位蛋白表达和蛋白含量。结论:玉凝膏治疗痤疮具有显著的疗效。