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研究背景：
母代肥胖可影响子代肝脏脂质代谢，增加子代慢性代谢性疾病风险。既往相关研究主要集中在炎症反应、氧化应激等途径，而关于非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)的表观遗传调控机制鲜有报道。环状RNA(circle RNA, circRNA)是一种特殊的内源性ncRNA，在基因表达调控中发挥重要作用，而circRNA是否参与母代肥胖导致子代肝脏“代谢重组”尚不清楚；自噬是生物体内重要的代谢途径，参与降解肝细胞内脂质，维持脂质代谢平衡，然而在该模型中自噬对脂质代谢的调控作用及分子机制研究仍显不足。
目的：
本研究旨在探讨以下问题：1.母代肥胖对子代肝脏脂质代谢的影响；2.母代肥胖是否通过改变子代肝脏circRNA的表达而对肝脏脂质代谢产生影响；3.circRNA_0000660作为关键基因，是否通过circRNA-miRNA-mRNA以及circRNA-自噬途径调控脂质代谢？
方法：
1.动物模型建立及标本收集：C57/BL6雌性小鼠随机分两组，分别喂养高脂饲料和正常饲料12周，以体重以及血生化指标为参考，判定高脂饮食诱导小鼠肥胖模型构建成功；再分别与健康雄性小鼠交配，自由分娩，子代小鼠第3周断奶，眼眶静脉丛采血后处死，收集肝脏组织。
2.脂质代谢指标检测：检测各组子代小鼠血清总胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)含量；采用H&E染色观察子代小鼠肝脏形态；采用油红O染色观察子代小鼠肝脏中脂质沉积状况。
3.circRNA表达分析：采用高通量测序法(High-throughput sequencing, RNA-Seq)对两组子代小鼠肝脏组织进行circRNA测序；分析circRNA表达谱，筛选差异circRNA；GO和KEGG分析对差异circRNA的宿主基因进行功能聚类；利用生物信息学方法对差异circRNA下游靶基因进行预测，构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络；进一步对circRNA靶基因与mRNA进行联合分析，筛选出关键circRNA并预测其潜在调控途径。
4.CircRNA-miRNA-mRNA调控通路验证：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、WesternBlot(WB)检测子代小鼠肝脏组织中circRNA_0000660及其下游靶基因miR_693和Igfbp1表达水平；棕榈酸(Palmitic acid， PA)诱导AML12细胞脂质沉积，构建细胞模型，siRNA以及miRNAinhibitor技术干扰细胞内circRNA和miRNA表达，检测circRNA下游靶基因表达，采用油红O染色检测细胞内脂质沉积情况；双荧光素酶报告实验验证circRNA-miRNA-mRNA的结合位点以及结合作用。
5.CircRNA对自噬的调控分析：qRT-PCR、WB、免疫荧光检测子代小鼠肝脏组织以及细胞模型中自噬指标LC3、p62以及mTOR信号通路指标表达；采用siRNA干扰细胞中circRNA_0000660表达，再次检测LC3和p62以及mTOR信号通路相关指标表达水平；采用mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素(rapamycin，Rapa)以及siRNA共同干预AML12细胞，检测细胞内脂质沉积状况。
结果：
1.母代肥胖导致子代小鼠肝脏脂质沉积：与正常组相比，肥胖组子代小鼠1~3周超重生长；在第3周时，TC、TG、LDL水平均高于正常组；H&E染色结果显示，肥胖组子代小鼠肝脏形态发生病变，出现明显空泡样结构；油红O染色结果显示，肥胖组子代小鼠肝脏出现明显脂质沉积现象。
2.母代肥胖改变子代小鼠肝脏circRNA表达谱：RNA-Seq结果显示，两组小鼠肝脏组织共鉴定3651个circRNA，包括231个差异circRNA，121个上调，110个下调；在对circRNA的宿主基因进行KEGG通路富集分析后，发现差异circRNA的宿主基因主要富集在脂质代谢相关通路中；对富集在脂质代谢通路中的circRNA进行circRNA-miRNA-mRNA网络构建，并与mRNA的转录组测序结果进行联合分析，确定circRNA_0000660为关键基因，并且可能通过circRNA_0000660-miRNA_693-Igfbp1调控机制对子代小鼠肝脏脂质代谢进行调控。
3.circRNA_0000660调控机制验证：qRT-PCR和WB结果显示，HFD-F1组小鼠circRNA_0000660与Igfbp1的表达均下降，与RNA-Seq结果一致，同时，在PA诱导的AML12细胞中，circRNA_0000660与Igfbp1的表达下降；采用siRNA技术干扰细胞内circRNA_0000660表达后，Igfbp1的表达进一步下降，细胞内脂质沉积加重，加入miR_693inhibitor干扰后，Igfbp1表达升高，脂质沉积减轻；双荧光素酶报告实验结果显示，circRNA_0000660-miR_693以及miR_693-Igfbp1之间都有明显结合作用。
4.circRNA_0000660对自噬的调控作用：qRT-PCR、WB和免疫荧光结果显示，肥胖组子代小鼠肝脏自噬相关指标LC3表达水平明显下降，p62表达水平明显升高，同时，PA诱导AML12细胞中，自噬水平下降；采用siRNA干扰AML12细胞后，自噬水平进一步下降，提示circRNA_0000660对自噬具有调控作用；qRT-PCR、WB结果显示，HFD-F1组小鼠肝脏组织中以及PA诱导AML12细胞中，p-mTOR表达水平升高；在siRNA干扰circRNA_0000660表达后，p-mTOR表达水平进一步升高。
结论：
母代肥胖导致子代小鼠肝脏脂质沉积，肝脏结构异常；母代肥胖同时改变子代小鼠肝脏circRNA表达谱，多数差异circRNA与脂质代谢相关，其中子代小鼠肝脏细胞circRNA_0000660表达受到抑制。circRNA_0000660可通过结合miRNA_693，干扰Igfbp1的表达，并通过mTOR信号通路调控肝脏细胞自噬水平，从而导致子代小鼠肝脏细胞内脂质代谢紊乱。
母代肥胖可影响子代肝脏脂质代谢，增加子代慢性代谢性疾病风险。既往相关研究主要集中在炎症反应、氧化应激等途径，而关于非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)的表观遗传调控机制鲜有报道。环状RNA(circle RNA, circRNA)是一种特殊的内源性ncRNA，在基因表达调控中发挥重要作用，而circRNA是否参与母代肥胖导致子代肝脏“代谢重组”尚不清楚；自噬是生物体内重要的代谢途径，参与降解肝细胞内脂质，维持脂质代谢平衡，然而在该模型中自噬对脂质代谢的调控作用及分子机制研究仍显不足。
目的：
本研究旨在探讨以下问题：1.母代肥胖对子代肝脏脂质代谢的影响；2.母代肥胖是否通过改变子代肝脏circRNA的表达而对肝脏脂质代谢产生影响；3.circRNA_0000660作为关键基因，是否通过circRNA-miRNA-mRNA以及circRNA-自噬途径调控脂质代谢？
方法：
1.动物模型建立及标本收集：C57/BL6雌性小鼠随机分两组，分别喂养高脂饲料和正常饲料12周，以体重以及血生化指标为参考，判定高脂饮食诱导小鼠肥胖模型构建成功；再分别与健康雄性小鼠交配，自由分娩，子代小鼠第3周断奶，眼眶静脉丛采血后处死，收集肝脏组织。
2.脂质代谢指标检测：检测各组子代小鼠血清总胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)含量；采用H&E染色观察子代小鼠肝脏形态；采用油红O染色观察子代小鼠肝脏中脂质沉积状况。
3.circRNA表达分析：采用高通量测序法(High-throughput sequencing, RNA-Seq)对两组子代小鼠肝脏组织进行circRNA测序；分析circRNA表达谱，筛选差异circRNA；GO和KEGG分析对差异circRNA的宿主基因进行功能聚类；利用生物信息学方法对差异circRNA下游靶基因进行预测，构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络；进一步对circRNA靶基因与mRNA进行联合分析，筛选出关键circRNA并预测其潜在调控途径。
4.CircRNA-miRNA-mRNA调控通路验证：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、WesternBlot(WB)检测子代小鼠肝脏组织中circRNA_0000660及其下游靶基因miR_693和Igfbp1表达水平；棕榈酸(Palmitic acid， PA)诱导AML12细胞脂质沉积，构建细胞模型，siRNA以及miRNAinhibitor技术干扰细胞内circRNA和miRNA表达，检测circRNA下游靶基因表达，采用油红O染色检测细胞内脂质沉积情况；双荧光素酶报告实验验证circRNA-miRNA-mRNA的结合位点以及结合作用。
5.CircRNA对自噬的调控分析：qRT-PCR、WB、免疫荧光检测子代小鼠肝脏组织以及细胞模型中自噬指标LC3、p62以及mTOR信号通路指标表达；采用siRNA干扰细胞中circRNA_0000660表达，再次检测LC3和p62以及mTOR信号通路相关指标表达水平；采用mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素(rapamycin，Rapa)以及siRNA共同干预AML12细胞，检测细胞内脂质沉积状况。
结果：
1.母代肥胖导致子代小鼠肝脏脂质沉积：与正常组相比，肥胖组子代小鼠1~3周超重生长；在第3周时，TC、TG、LDL水平均高于正常组；H&E染色结果显示，肥胖组子代小鼠肝脏形态发生病变，出现明显空泡样结构；油红O染色结果显示，肥胖组子代小鼠肝脏出现明显脂质沉积现象。
2.母代肥胖改变子代小鼠肝脏circRNA表达谱：RNA-Seq结果显示，两组小鼠肝脏组织共鉴定3651个circRNA，包括231个差异circRNA，121个上调，110个下调；在对circRNA的宿主基因进行KEGG通路富集分析后，发现差异circRNA的宿主基因主要富集在脂质代谢相关通路中；对富集在脂质代谢通路中的circRNA进行circRNA-miRNA-mRNA网络构建，并与mRNA的转录组测序结果进行联合分析，确定circRNA_0000660为关键基因，并且可能通过circRNA_0000660-miRNA_693-Igfbp1调控机制对子代小鼠肝脏脂质代谢进行调控。
3.circRNA_0000660调控机制验证：qRT-PCR和WB结果显示，HFD-F1组小鼠circRNA_0000660与Igfbp1的表达均下降，与RNA-Seq结果一致，同时，在PA诱导的AML12细胞中，circRNA_0000660与Igfbp1的表达下降；采用siRNA技术干扰细胞内circRNA_0000660表达后，Igfbp1的表达进一步下降，细胞内脂质沉积加重，加入miR_693inhibitor干扰后，Igfbp1表达升高，脂质沉积减轻；双荧光素酶报告实验结果显示，circRNA_0000660-miR_693以及miR_693-Igfbp1之间都有明显结合作用。
4.circRNA_0000660对自噬的调控作用：qRT-PCR、WB和免疫荧光结果显示，肥胖组子代小鼠肝脏自噬相关指标LC3表达水平明显下降，p62表达水平明显升高，同时，PA诱导AML12细胞中，自噬水平下降；采用siRNA干扰AML12细胞后，自噬水平进一步下降，提示circRNA_0000660对自噬具有调控作用；qRT-PCR、WB结果显示，HFD-F1组小鼠肝脏组织中以及PA诱导AML12细胞中，p-mTOR表达水平升高；在siRNA干扰circRNA_0000660表达后，p-mTOR表达水平进一步升高。
结论：
母代肥胖导致子代小鼠肝脏脂质沉积，肝脏结构异常；母代肥胖同时改变子代小鼠肝脏circRNA表达谱，多数差异circRNA与脂质代谢相关，其中子代小鼠肝脏细胞circRNA_0000660表达受到抑制。circRNA_0000660可通过结合miRNA_693，干扰Igfbp1的表达，并通过mTOR信号通路调控肝脏细胞自噬水平，从而导致子代小鼠肝脏细胞内脂质代谢紊乱。