鸡痘是危害养鸡业发展的一种重要传染病,成鸡发病后一般不造成死亡,雏鸡死亡率较高,黏膜型鸡痘的症状比较严重,有时可引起较高的死亡率。鸡痘可使病禽生长迟缓,产蛋下降,若并发其他传染病、寄生虫病和营养状况、卫生条件不良时也可引起大批死亡。近些年来,鸡痘的发生率又有增高的趋势,并且出现了流行的新特点,即发病鸡群的病程加长,且常并发大肠杆菌、葡萄球菌病以及传染性鼻炎、慢性呼吸道疾病,造成大批鸡死亡。目前,对鸡痘的预防主要是接种鸡痘或鸽痘病毒弱毒疫苗。国内外常用的鸡痘疫苗,不管是细胞苗还是组织苗,其生产都离不开鸡胚。若用SPF鸡胚生产鸡痘疫苗,成本比较高,降低了厂家的经济效益,许多生物制品厂很难达到此要求。但如果采用普通鸡胚,又有可能带来隐性的病毒或其他病原体的感染,从而影响疫苗安全性,削弱疫苗的保护效果。其次,由于病毒在鸡胚内的增殖不易量化,病毒增殖受鸡胚胚龄、健康状况的影响,因此生产的疫苗存在稳定性方面的问题。对鸡痘的防控,可从病毒致病机制研究及鸡痘病毒疫苗制备两方面进行:一方面可以寻找对鸡痘病毒敏感的宿主细胞,从分子和细胞水平上阐明病毒的致病机制,从而找到行之有效的疾病诊断和治疗的手段;另一面是寻找一种对鸡痘病毒敏感的、无内源性污染的、来源丰富的细胞,作为鸡痘病毒生长的载体,来研发安全、稳定性高而成本低的鸡痘疫苗。基于这两个目的,本试验分离培养了7日龄鸡胚绒毛尿囊膜上皮细胞,并进行了鸡痘弱毒在该上皮细胞的增殖特性研究。获得以下结果:(1)使用组织块法和3种酶消化法分离鸡胚绒毛尿囊膜上皮细胞,结果显示,链酶蛋白酶消化的细胞虽活力比较高,但是成纤维混杂很严重。组织块法因获得上皮细胞克隆很少而难以纯化。胶原酶(200 IU/mL)和透明质酸酶(1.0 g/L)配合消化可获的纯度比较高的上皮细胞,细胞活性检测可达90%,贴壁后增殖能力强,细胞活力旺盛,在体外可传至5～7代。通过优化原代细胞分离方法,我们分离得到了纯度高、活力旺盛的绒毛尿囊膜上皮细胞,为进一步的研究提供良好的细胞来源,为建立绒毛尿囊膜上皮细胞系奠定了基础。(2)通过将鸡痘鹌鹑化弱毒接种单层生长的绒毛尿囊膜上皮细胞,研究其在上皮细胞的增殖特性。研究结果显示,绒毛尿囊膜上皮细胞对鸡痘弱毒敏感,10-3、10-4和10-5 3个稀释度的病毒感染上皮细胞,培养36 h开始出现细胞病变。病变的细胞圆缩、聚集,可见合胞体巨细胞的形成。鸡痘弱毒经鸡胚复壮后,可在绒毛尿囊膜上皮细胞中增殖并很快诱导细胞病变。可见绒毛尿囊膜上皮细胞是鸡痘病毒较为理想的宿主细胞,可为鸡痘病毒致病机制研究提供良好的细胞模型。(3)鸡痘弱毒经稀释后,接种到汇合度为80%～90%的绒毛尿囊膜上皮细胞,进行适应性传代,共传6代,收获不同代次的鸡痘弱毒。通过对F1～F6代鸡痘弱毒的蚀斑滴定和F2、F4和F6代弱毒EID50的测定,计算各代次的病毒含量。蚀斑滴定结果显示,F4、F5和F6代病毒的空斑形成单位均大于107 pfu/mL,病毒含量高且相对稳定。EID50结果表明,F2、F4和F6代鸡痘弱毒毒价等于或大于105.5 EID50/0.2 mL,达到中国《兽用生物制品规程》的要求。通过对雏鸡接种约含100个使用剂量的F1～F6代次鸡痘弱毒,雏鸡健康状况良好,无异常反应,表明鸡痘弱毒在绒毛尿囊膜上皮细胞上无毒力增强的趋势。本试验为用鸡胚绒毛尿囊膜上皮细胞替代鸡胚生产鸡痘弱毒疫苗提供了依据。