水稻黄单胞菌KACC10331双组分系统的生物信息学分析及体外磷酸传递研究

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黄单胞菌属(Xanthomonas)种类繁多,致病性也非常多样,其包含的所有种都是植物病原菌,能引起植物产生叶斑、叶枯,甚至萎蔫、溃疡,对农业生产造成巨大的危害。双组分信号传导系统(Two-component signal transduction system,TCS)是由具备跨膜结构域的组氨酸激酶(Histidine kinase,HK)以及在胞内具备转录因子活性的反应调节蛋白(Response regulator,RR)组成,是广泛参与细菌生理生化调节的信号传导系统。本文主要利用生物信息学方法对已完成全基因组测序的8株黄单胞菌属菌株的TCS进行了预测和结构分析,并选取水稻黄单胞菌KACC10331作为研究对象,对HK的体外自磷酸化,RR的体外磷酸化以及HK/RR体外磷酸传递进行了研究,旨在建立黄单胞菌TCS体外磷酸化传递图谱,为深入研究TCS对其生长、代谢以及毒力因子表达调控奠定基础。  1)采用生物信息学方法,系统地分析了已完成全基因组测序的8株黄单胞菌的TCS。包括TCS的分布、结构和进化关系,并在蛋白质水平上对相关TCS的功能进行预测,在此基础上构建了黄单胞菌中部分TCS的调控网络关系图。  2)分别构建了水稻黄单胞菌KACC10331中部分HK和RR的大肠杆菌表达载体,经诱导表达并通过Ni-NTA和GST树脂纯化获得高纯度的TCS蛋白共30个。  3)根据 HK发生自磷酸化作用时会将ATP分子分解为ADP这一特性,利用HPLC对纯化得到的HK进行自磷酸化检测,结果显示,10个HK中有7个(HK1、HK4、HK6、HK7、HK8、HK9和HK11)能发生自磷酸化;再利用[γ-32P]ATP对这10个HK进行测试,通过检测放射性信号进一步证明了HK1、HK7、HK8和HK10能在体外进行自磷酸化。利用反应调节蛋白可以接收一类小磷酸分子如乙酰磷酸发生磷酸化并使其空间构象发生改变而增强抗胰蛋白酶降解这一特性,我们发现14个RR中有9个(RR3、RR4、RR6、RR8、RR10、RR11、RR12、RR13和RR16)能发生磷酸化。  4)在磷酸传递的研究中,以HK7、HK8作为磷酸传递的中间体,以RR10作为受体的一组实验结果表明RR10与HK区域之间发生了磷酸基团的转移;以HK1和HK10作为中间体,以RR10作为受体的为一组的实验结果表明RR4也由于HK的存在发生了磷酸化。
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