论文部分内容阅读
目的构建实验所需的真核表达载体，特别是人源性tRNA val启动子驱动CTE介导的核酶高效表达载体pPHCV5-CR以及对应的无CTE介导的载体pPHCV5-R；建立HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株；探讨核酶和核酶-CTE复合物对丙型肝炎病毒亚基因组的影响，进一步探讨丙型肝炎治疗研究方向。研究方法1、构建相应的核酶载体合成CTE-DNA，设计、构建含tRNAval启动子的核酶和带有CTE的含tRNAval启动子的核酶。2、建立HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株在脂质体lipofectamine TM2000介导下，将含有HCV Subgenes的真核表达质粒pHCV BM4-5导入人肝癌细胞系QSR7701中，经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法证实转染成功及其蛋白表达。3、观察四种质粒pPHCV5-R1、pPHCV5-R2、pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2对HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株中HCV RNA和相应病毒蛋白表达的影响。结果1、经测序后证实，成功构建相应的核酶载体，为下一步实验奠定基础。2、经RT-PCR和Western Blot证实，成功建立稳定转染HCVSubgenomic Replicon和表达的细胞株。3、用构建的普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和复合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬时转染含HCV亚基因复制子的稳定转染QSG7701细胞株，48小时后收集细胞进行RT-PCR和WesternBlot，RT-PCR(以β-actin为内对照)结果显示：pPHCV5-CR1转染组未见明显扩增目的条带，pPHCV5-R1转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组；pPHCV5-CR2转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组，pPHCV5-R2转染组可见扩增目的条带，亮度与未转染组和空质粒转染组接近。这些提示：复合核酶(带有CTE)在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，复合核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。WesternBlot(以β-actin为内对照)结果显示：应用软件分析各组细胞目的蛋白表达量无明显差异，可能与瞬时转染作用时间短、蛋白表达变化不明显，也可能与实验重复次数少、可用数据少或者检测方法有关。结论新型核酶(带有CTE)在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，带CTE-核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。