荞麦具有较高营养品质和药用价值，并富含多种生物活性物质，在防治现代文明病诸如糖尿病、高血压等心脑血管疾病和风湿性关节炎等方面有一定的功效。然而荞麦中含有的过敏性成份又使许多接触或食用它的人产生过敏症状。近些年来，一些国外的科学家对甜荞（common buckwheat CB）中的过敏成分进行了研究。但在苦荞（tartary buckwheat TB）过敏成分研究方面的报道却不多，有关苦荞过敏蛋白的基因克隆及表达调控的研究尚属空白。 TB22kDa蛋白是苦荞中的主要过敏蛋白，对此蛋白中抗原决定簇免疫学和分子遗传学的深入研究，将有助于了解过敏反应机制并设计抑制荞麦过敏蛋白的表达或使患者脱敏的方法。本研究的目的在于分离克隆苦荞中的主要过敏蛋白（TB22kDa）基因，并表达纯化出其结构基因编码的蛋白。从而为进一步研究过敏蛋白TB22kDa的结构与功能，寻找其中的抗原决定簇，探讨过敏原与其相应抗体相互作用机理提供依据。 本研究根据先前分离纯化所得天然TB22kDa蛋白经MALDI-TOF-MS（质谱法）测得的氨基酸序列和文献报道的过敏蛋白核苷酸序列设计引物，扩增克隆了该过敏蛋白结构基因的编码序列；根据测得的序列设计特异性引物，并利用3’-RACE方法结合巢式PCR扩增得到基因的3’末端；依据同源性比较的结果选用一段保守序列为5’引物，并根据结构基因内部序列设计3’特异性引物，进一步获得了该基因5’端的部分序列。已得到的基因序列长度为1311bp。从已有的5’部分序列到该过敏蛋白编码区为543bp，编码181个氨基酸。开放阅读框588 bp，包括编码区的585bp及一个终止密码，可编码一个由195个氨基酸组成的功能蛋白。3’端非编码区包括180个碱基，富含AT（70％）。 采用上述方法获得的TB22kDa核苷酸序列与甜荞过敏性贮藏蛋白及豆球类蛋白的同源性分别达到94％和90％；氨基酸序列与来自甜荞中的球蛋白，刀豆蛋白有93％-83％同源性。TB22kDa蛋白与已知过敏原氨基酸序列比较显示，其中183—188位的序列KEEEKE在不同过敏原中都有存在，推测可能为潜在的抗原决定簇。 目前，此过敏蛋白TB22kDa的结构基因与3’端基因序列已在GenBank登录，登录号为AY044918。来源于苦荞中的过敏蛋白基因序列在国内外尚属首次报道。 根据已知的序列设计特异性引物，PCR扩增TB22kDa蛋白编码区，并将其连接在表达载体pQE-31上，获得重组质粒pQE-31（H1-H2）。将此质粒转化E.coliM15感受态细胞，构建工程菌E.coli M15／pQE-31（H1-H2），于37℃在LB培养基中培养至OD₆₀₀=0.5-0.7，加入IPTG至终浓度为0.5mmol／L诱导表达。SDS-PAGE分析表明，重组菌在分子量20-30kDa处出现一高表达蛋白条带，此诱导表达的蛋白在沉淀中以包涵体形式存在。对此表达蛋白变性处理后，经HiTrap^TM Chelating亲和柱初步纯化，纯度达90％。