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脂肪组织作为机体内重要的代谢器官之一,它包括白色、米色和棕色脂肪三种。白色脂肪组织以储能为主,而棕色和米色脂肪组织以产热耗能为主。有研究报道在寒冷、激动剂等刺激下,白色脂肪能够向米色脂肪细胞表型转化,进而燃烧脂肪,增强能量消耗,改善肥胖。另外有研究发现脂肪因子脂联素可以与T连接蛋白结合,通过增加M2细胞的增殖来促进皮下脂肪的棕色化。而锌α 2糖蛋白(ZAG)是近几年被发现的一种新型脂质动员因子,相关报道认为ZAG能够促进脂肪分解,提高脂肪酸β氧化,降低体重和脂肪含量。近期有研究首次报道了 ZAG可以促进脂肪细胞的棕色化,但是关于ZAG与白脂棕色化关系的研究还很不清楚。因此,本试验旨在通过动物实验,建立肥胖与冷应激小鼠模型,探究两种情况下ZAG对于白脂棕色化的影响及机制。1注射ZAG质粒对高脂诱导的肥胖小鼠白脂棕色化的影响本实验采用4周龄C57BL/6J雄性小鼠,将其随机分为两组,对照组饲喂正常日粮,实验组饲喂高脂日粮。饲喂8周之后成功建立肥胖模型,将正常饮食小鼠分为两组:注射空质粒组(ND)和注射ZAG重组质粒组(NDZ);将高脂饮食小鼠也分为两组:注射空质粒组(HF)和注射ZAG重组质粒组(HFZ)。每三天注射一次,共注射8次,记录每周体重增长状况,采集附睾脂肪组织及血样。结果显示:与ND组相比,HF组的小鼠体重极显著升高(P<0.01)。在注射质粒之后,NDZ和ND组相比、HFZ和HF组相比,ZAG的蛋白水平都极显著升高(P<0.01)、小鼠的体重都显著下降(P<0.05)。在高脂日粮饲喂小鼠中,注射ZAG重组质粒后显著降低了小鼠附睾脂的重量(P<0.05),但对正常饮食的小鼠没有影响。注射ZAG重组质粒后显著降低了血清中NEFA的水平(P<0.05)。HFZ组血清中CHOl、HDL-C和LDL-C水平显著低于HF组(P<0.05)。NDZ组的棕色化marker CD137的mRNA水平显著高于ND组(P<0.05),HFZ组的棕色化marker UCP1和CD137、能量代谢因子UCP3和C/EBPβ的mRNA水平显著高于HF组(P<0.05),另外,NDZ组的棕色化和能量代谢因子CD137、C/EBPβ的蛋白水平显著高于ND组(P<0.05),HFZ组的棕色化和能量代谢因子CD137、C/EBPβ的蛋白水平显著高于HF组(P<0.05),而其他脂代谢相关因子没有明显变化。以上结果表明,在高脂日粮诱导的肥胖小鼠中,ZAG能够通过促进附睾脂肪的棕色化、提高能量代谢,从而减少脂肪沉积,降低小鼠体重。2 ZAG基因缺失对冷应激小鼠白脂棕色化的影响本实验采用冷应激模型诱导白脂棕色化,探究ZAG缺失对白脂棕色化的影响及其分子机制。实验采用全身敲除ZAG基因的8周龄C57BL/6J雄性小鼠,饲喂正常日粮,适应7天后,将其随机分为两组,一组在22℃环境下饲养,另一组在6℃环境下饲养,另有野生型小鼠作为对照,将四组小鼠(WT22℃、ZAG KO 22℃、WT6℃、ZAG KO 6℃)处理一周并记录各组小鼠体重的变化。一周结束后通过腹腔注射戊巴比妥钠来麻醉小鼠,眼球采血,采集小鼠皮下脂、附睾脂和棕色脂,称重记录。结果显示:在野生型(WT)小鼠中,冷应激之后ZAG的蛋白水平显著升高(P<0.05)。在ZAG敲除鼠中,ZAG蛋白不表达。另外冷应激之后,野生型小鼠皮下脂、棕色脂和附睾脂ZAG的mRNA水平都显著升高(P<0.05)。在冷应激情况下,野生鼠的体重显著低于ZAG敲除鼠(P<0.01);并且野生鼠皮下脂(腹股沟脂和前肢背部皮下脂)、附睾脂、肌肉的重量以及皮下脂与体重的比值显著低于ZAG敲除鼠(P<0.05)。在冷应激情况下,野生鼠的皮下脂棕色化marker CD137、Tbx1的表达显著高于ZAG敲除鼠(P<0.05),而在正常温度环境下没有明显变化。在冷应激情况下,WT鼠的皮下脂肪分解因子HSL和ATGL、能量代谢因子PGC1α、UCP3和C/EBPβ的表达显著高于ZAG敲除鼠(P<0.05),野生鼠的皮下脂线粒体编码基因显著高于ZAG敲除鼠(P<0.05)。WT鼠的皮下脂肪组织中β3-AR、PPAR-γ、P-P38蛋白水平在冷应激情况下显著高于ZAG敲除鼠(P<0.05)。冷应激下,野生鼠的附睾脂棕色化marker、脂肪分解和能量代谢因子以及棕色脂肪能量代谢因子的mRNA水平显著高于ZAG敲除鼠(P<0.05)。以上结果表明,冷应激导致了机体内ZAG的表达增加,而ZAG缺失会抑制冷应激诱导的白色脂肪棕色化,同时抑制脂肪组织能量消耗以及脂质的动员。而这一作用是通过β3-AR/P-P38/PPAR-γ信号通路实现的。3注射ZAG质粒对冷应激条件下ZAG敲除鼠白脂棕色化的影响本实验通过给ZAG敲除鼠注射ZAG质粒,探究外源性添加ZAG对冷应激条件下ZAG敲除鼠白脂棕色化的影响。实验采用全身敲除ZAG基因的8周龄C57BL/6J雄性小鼠,将其随机分为两组,一组注射空质粒(Control 6℃),另一组注射ZAG重组质粒(ZAG 6℃)。将两组小鼠放于6℃环境中饲养一周,一周结束后采集小鼠皮下脂、附睾脂和棕色脂,称重记录。结果显示:注射ZAG质粒之后,皮下脂中ZAG的表达明显增加。小鼠皮下脂(包括腹股沟脂和前肢背部皮下脂)和附睾脂的重量在注射ZAG质粒后显著低于对照组(P<0.05)。冷应激情况下,在注射ZAG质粒组中,皮下脂肪棕色化marker UCP1、Tbx1和能量代谢因子PGC1α、UCP3、C/EBPβ的蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。ZAG组的皮下脂肪组织中线粒体结构较好,而对照组中皮下脂肪的线粒体内部结构不完整。另外冷应激情况下,在注射ZAG质粒组中,附睾脂肪棕色化marker UCP1、Prdm16、CD137和脂肪分解因子ATGL、能量代谢因子UCP3、C/EBPβ、CPT1A的mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。ZAG组棕色脂肪能量代谢因子UCP3、C/EBPβ、CPT1B的mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。以上结果表明,外源性添加ZAG增加了冷应激条件下ZAG敲除鼠脂肪的消耗,减少了脂肪沉积;ZAG促进了白色脂肪的棕色化,同时改善线粒体功能,增加能量消耗,促进产热。4转染ZAG质粒对3T3-L1脂肪细胞棕色化的影响在前面的研究中,我们发现了 ZAG可以促进肥胖和冷应激小鼠白色脂肪的棕色化。本部分研究中,我们采用3T3-L1细胞进行实验,研究体外情况下,过表达ZAG对脂肪细胞棕色化的影响。结果显示:注射ZAG质粒之后,脂肪细胞中ZAG的表达显著增加(P<0.05)。过表达ZAG显著增加了棕色化marker UCP1、Tbx1和能量代谢因子PGC1α、CPT1A的蛋白水平(P<0.05)。线粒体膜电位与棕色化marker解偶联蛋白是呈负相关的,ZAG显著降低了脂肪细胞线粒体的膜电位(P<0.05)。线粒体数量的增加是白脂棕色化的一个关键特征,过表达ZAG组中脂肪细胞的线粒体含量明显高于对照组(P<0.05)。另外ZAG显著上调了 β3-AR和P-P38蛋白的表达(P<0.05)。以上结果表明,体外过表达ZAG可以诱导3T3-L1细胞向米色脂肪细胞表型转化,同时伴随着线粒体含量的增加和能量代谢的增强,这种调节作用的可能机制是依赖于β3-AR/P-P38信号通路。