研究目的本研究目的：(1)．建立一组P53截短突变群，并建立真核细胞表达系统，分析该突变群对细胞内与DNA损伤修复过程相关基因的表达变化；(2)．分析细胞在紫外线照射条件下的一系列生理变化，分析DNA损伤修复和细胞凋亡相关基因的表达及它们之间的相互关系：(3)．主要P53相关基因的克隆及表达分析。主要研究方法 1．采用PCR定点突变方法，以野生型P53基因为模板，以设计的7条引物交叉配对成12组，PCR扩增获得12个不同的P53缺失突变基因，DNA测序证明所有缺失突变基因序列准确性；构建相应的真核细胞表达载体，以及腺病毒基因表达载体。利用这一组表达载体，采用脂质体法转染Hela细胞，以RT-PCR法进行表达分析，并初步分析其对P53下游基因表达的影响。 2．采用紫外线直射照射Hela细胞，分析紫外线照射(波长254nm，辐照强度45微瓦／平方厘米)引起细胞凋亡的时间与剂量关系，分析DNA损伤程度与细胞凋亡的关系以及细胞内各个P53下游基因的表达变化。 3．采用RT-PCR技术，对P53相关的下游基因进行克隆，并建立相应的真核表达载体，以便分析这些基因在P53信号转导途径中的作用与地位。研究结果 一、PS3截短突变群的构建与表达分析 1．采用PCR定点突变技术获得了十二个人p53基因及其缺失突变基因，并对每一个缺失突变基因进行DNA序列测定，证实所有突变基因序列与预期一致； 2.将获得的p53缺失突变基因克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，分别获得了能够转录产生相应的正义和反义mRNA的重组载体； 3.以脂质体法将重组真核表达质粒转染Hela细胞，建立了永久性表达细胞株，RT-PCR分析获得了相应的目标基因表达； 4.对转染有p53及其缺失突变基因的Hela细胞，以RT-PCR法，分析了细胞内P53下游基因mdm2、p21、gadd4S、bax、p16、等基因表达的情况，发现在转染细胞中存在一些基因表达模式的变化； 5．构建了p53缺失突变基因的重组腺病毒表达载体。 二、紫外线照射Hela细胞的细胞学反应 1．当Hela细胞受紫外线照射15分钟，细胞发生凋亡，而当紫外线照射继续延长，到30分钟或以上时，细胞更多地因蛋白质凝固死亡，而非细胞凋亡；细胞凋 中文摘要 一 亡在细胞接受紫外线照射后12小时时发生： 2．细胞DNA损伤程度在紫外线照射从0－25分钟之间，表现为剂量相关性，而 继续延长紫外线照射时间，则细胞的DNA ＃出又变少； 3．紫外线照射Hela细胞后，P53的表达随着紫外线照射时间延长，P53表达持 续增加，同时，pl6、pZI、gadd45及bax基因均有明显的表达升高，但在我 们的实验系统中，没有检测到mdmZ基因的表达。 三、P53主要相关基因的克隆及表达分析 1．克隆得到p53相关的几个主要下游基因，它们是mdlnZ、pZI、gadd45、pl6 及bax，并进行了序列测定，证实与文献报道一致： 2．对 mdmZ和阅还建立了相应的真核表达载体，转染 Hela细胞获得了稳定表 达目标基因的建株细胞。 结论： 建立了一套p53基因截短突变群，并在Hela细胞得到稳定表达：紫外线照射 可引起Hela细胞DNA损伤与细胞凋亡，细胞内与DNA损伤的细胞凋亡基因表 现显著升高；克隆得到几个主要的P53相关基因。 本课题仅仅是P53研究的开端，为从细胞水平上分析DNA损伤的反应，分析 P53及其与下游基因的相互作用关系的研究打下一定的基础。