作为重要的昆虫病原真菌,球孢白僵菌(Beauveria bassiana)很难通过口器摄入经肠壁侵染寄主,但其机理不明。本研究首先筛选出一株稳定表达绿色荧光蛋白的球孢白僵菌遗传转化菌株,然后模拟昆虫中肠环境处理其两种孢子,采用流式细胞术检测处理后孢子荧光强度的变化以反映孢壁的受损程度,并用扫描电子显微镜观测处理后孢壁表面形态,最后测定处理后两种孢子的萌发率以反映对孢子活力的影响。主要内容和结果分述于下:遗传转化菌株的生物学筛选从六个转化子菌株中筛选出能代表野生型菌株生理生化特征的高效表达绿色荧光蛋白的菌株。测定六个转化子菌株的分生孢子荧光强度强弱,结果显示Bb2860G6是最优的荧光强度最强的菌株。耐热力测定结果显示,菌株Bb2860G6、Bb2860G12和Bb2860G4在热胁迫后的残存活孢率均在55%以上,孢子耐热力极强。测定Bb2860G0、Bb2860G1、Bb2860G6和Bb2860G8四个菌株的菌落生长情况,Bb2860G1的菌落面积显著较低,其他三个菌落面积差异不显著。用Bb2860G0、Bb2860G6和Bb2860G8这三株菌进行对桃蚜的生物测定,结果表明三个菌株的孢子悬液对桃蚜的剂量效应与时间效应都极显著,Bb2860G6与Bb2860G0的时间效应值接近,杀蚜效应接近。综合各项生物学筛选指标,最终选取Bb2860G6菌株为最终的研究对象。模拟昆虫中肠环境对分生孢子的影响配置单一或者复合的模拟昆虫中肠消化液,使Bb2860G6分生孢子悬浮于其中,恒温水浴后,采用流式细胞术测定其荧光强度的变化情况,结果显示:不同浓度的蛋白酶K、胰蛋白酶、链霉蛋白酶E、纤维素酶处理后均引起被检荧光强度的上升,并呈现先上升后下降的趋势。α-淀粉酶、蜗牛酶、葡萄糖苷酶、昆布多糖酶处理组只引起被检荧光强度的轻微变化,并呈现出下降趋势。经两种复合酶模拟消化液处理后,两种复合酶液均引起被检荧光强度的下降,然而下降幅度有所差异:蛋白酶K和纤维素酶引起孢子荧光强度降低8%-21%,胰蛋白酶和纤维素酶导致37%-43%的下降幅度。在pH 5-11范围内,两种复合酶液处理后孢子的相对荧光强度有所下降,分别为对照的53%-72%和77%-97%。电镜照片显示荧光强度上升的处理组孢子壁表面蛋白纹路模糊,孢壁变薄;而荧光强度下降的处理组孢壁部分结构不完整,甚至出现孔洞。测定经不同的模拟消化液处理后的分生孢子萌发率,结果显示,单一酶模拟消化液处理后分生孢子萌发率出现不同程度的降低,胰蛋白酶引起萌发率下降幅度最大(31%)。pH5-11条件下用两种复合酶模拟消化液处理分生孢子,萌发率均出现大幅度的降低。胰蛋白酶和纤维素酶组合引起萌发率下降30-98%,蛋白酶K和纤维素酶组合引起萌发率下降21-91%。模拟昆虫中肠环境对芽生孢子的影响采用同分生孢子相同的样品处理方法,使模拟昆虫中肠消化液作用于Bb2860G6芽生孢子,流式细胞术检测结果显示:不同浓度的蛋白酶K、胰蛋白酶、链霉蛋白酶E、纤维素酶处理后均引起被检荧光强度的上升,但随浓度增大上升趋势变化不明显;经昆布多糖酶和α-淀粉酶处理后,荧光强度呈现先升高后下降的趋势;而经蜗牛酶、葡萄糖苷酶处理后,随浓度升高被检荧光强度呈下降趋势。经两种复合酶模拟消化液处理后,胰蛋白酶和纤维素酶组合导致荧光强度上升8%-48%,随酶液浓度的上升,荧光强度上升幅度增大;蛋白酶K和纤维素酶组合则随酶液浓度上升荧光强度上升幅度减小(10%-3%),1%浓度甚至引起被检荧光强度下降15%。在pH 5-11范围内,两种复合酶模拟消化液处理后孢子的相对荧光强度有所上升,分别为对照的2.14-1.35倍和1.01-1.36倍。扫描电镜观测结果显示蛋白酶处理后芽生孢子表面未出现明显变化,而糖苷酶类处理后孢子表面不再光滑平整,被消减而变得不平。测定经不同的酶液处理后的分生孢子萌发率,结果表明,单一酶模拟消化液处理后芽生孢子萌发率出现不同程度的降低。其中,昆布多糖酶引起萌发率下降幅度最大(30%)。pH5-11条件下胰蛋白酶和纤维素酶组合引起萌发率下降49-78%,蛋白酶K和纤维素酶引起萌发率下降43%-67%。综上所述,本研究主要测定了模拟昆虫中肠消化液处理后球孢白僵菌的两种孢子荧光强度及萌发率的变化情况,结合扫描电镜的观测结果,说明了昆虫肠道中的各种酶和酸碱度对孢子壁有不同程度的消减和损伤,揭示了抑制孢子萌发的关键肠道因子,为杀虫机理的研究提供了线索。