论文部分内容阅读
第一部分USP47在中枢神经系统的表达定位研究目的:探讨USP47在中枢神经系统的表达特点及定位。方法:1.通过免疫印迹技术了解USP47在中枢神经系统的发育表达特点。2.通过免疫荧光技术了解USP47在中枢神经系统的表达分布。结果:1.USP47在刚出生时即在小鼠海马、皮层具有丰富的表达,且其表达水平随着发育成熟逐渐降低。2.免疫荧光显示在人脑组织皮层和成年小鼠海马与皮层脑组织中,USP47与神经元标记物NeuN存在共表达,但不与星形胶质细胞标志物GFAP共表达。另外,USP47主要定位于神经元胞浆,未在细胞核见到明显定位。结论:USP47随神经系统发育成熟蛋白表达水平逐渐降低,且主要定位于神经元胞浆,不在星形胶质细胞表达。第二部分USP47在中枢神经系统的功能研究目的:探讨USP47在中枢神经系统可能具有的功能。方法:1.构建靶向敲减USP47表达的慢病毒,并转染原代培养海马神经元,通过免疫印迹技术验证其敲减效率。2.采用Label-free定量蛋白质组学技术和串联质谱技术鉴定USP47相关靶点以及相互作用蛋白,并利用生物信息学软件分析。3.采用细胞电生理技术分析USP47对神经元突触传递的影响。4.采用免疫荧光技术分析USP47在突触的定位。结果:1.通过质谱检测及生物信息学发现,USP47在神经元胞浆、胞膜表达,可能与早期内吞体介导的内吞有关,另外USP47主要定位于突触后膜,可能与谷氨酸突触传递及AMPA受体的调控有关。2.细胞电生理发现USP47主要影响微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)的幅值,而非频率,但不影响微小抑制性突触后电流(mIPSCs)的幅值和频率。3.免疫荧光发现USP47主要与兴奋性突触后标记物PSD95共定位,而不与突触前标记物Synaptophysin共定位。结论:USP47主要定位于兴奋性神经元突触后,且参与了谷氨酸兴奋性突触传递。第三部分USP47调控AMPA受体的作用机制研究目的:证实USP47与AMPAR结合,并验证USP47对AMPAR的调控作用。方法:1.提取小鼠海马组织蛋白样本,通过体内免疫共沉淀实验验证USP47与谷氨酸受体的结合作用。2.体外共转染pcDNA3.1-mUSP47-Flag质粒与以pCI-SEP为载体的GluR1、GluR2、NR1、NR2A或者NR2B的受体表达质粒至HEK293细胞,并利用体外免疫共沉淀实验验证USP47与谷氨酸受体的结合。3.免疫印迹验证USP47对AMPAR蛋白表达水平的影响。4.免疫荧光验证USP47与参与受体运输有关细胞器的共定位。结果:1.通过体内免疫共沉淀证实USP47可以AMPAR亚基(GluR1和GluR2)以及NMDAR亚基(NR1、NR2A、NR2B)相结合,即USP47属于受体形成的蛋白复合物成员。2.通过体外免疫共沉淀证实USP47与AMPAR亚基(GluR1和GluR2)以及NMDAR亚基(NR1、NR2A、NR2B)可直接结合。3.敲减USP47表达可降低原代神经元中AMPAR亚基GluR1和GluR2的总蛋白表达水平。4.USP47主要与早期内吞体标记物EEA1(与膜受体内吞有关)和溶酶体标记物Lamp2(与蛋白降解有关,膜AMPAR多经溶酶体途径降解)存在共定位,而不与晚期内吞体标记物Rab7及循环内吞体标记物Rab11共定位;结论:USP47可能与AMAPR亚基GluR1、GluR2直接作用并调控AMPAR的总蛋白表达水平,另外通过USP47亚细胞定位实验发现USP47有可能介导AMPA受体的内吞,并影响其经溶酶体途径的降解。第四部分USP47在癫痫脑组织的表达及对癫痫发作易感性的影响目的:探讨USP47在癫痫的表达,并分析其对癫痫发作易感性的影响。方法:1.收集难治性癫痫术后颞叶皮层标本作为癫痫组,脑外伤颅内减压术后颞叶皮层组织标本作为对照组,验证USP47在人脑皮层组织的差异表达。2.建立戊四氮点燃小鼠模型,验证USP47在点燃小鼠皮层及海马组织的差异表达。3.慢病毒转染小鼠海马,验证USP47敲减后对点燃小鼠癫痫发作易感性的影响。结果:1.UPS47在人脑组织标本和小鼠点燃模型脑组织标本中均表达升高。2.USP47表达敲减后,小鼠首次癫痫发作的潜伏期延长,造模第14-28天的4-5级发作持续时间缩短,次数减少。结论:在癫痫患者及点燃小鼠模型中USP47表达上调,敲减USP47表达可降低癫痫发作易感性。