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目的:胱抑素C(CystatinC,CysC)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白,是管家基因表达的产物。在人血清中CysC的浓度恒定,不受饮食、年龄、性别等外在因素影响,而当发生肾功能损伤时,血清中CysC的浓度会因肾小球滤过能力的降低而增加。目前CysC作为反应肾小球滤过率(glomerularfiltrationrate,GFR)的重要血清标志物被广泛运用于临床的检测中,并随之发展出一系列检测方法,但国内检测试剂中仍缺乏合适的CysC抗体,主要依赖于进口的检测试剂和技术,制备特异性、亲和性高的CysC抗体是目前所需要的。本研究以基因重组策略制备CysC蛋白抗原,并以此免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤融合技术制备符合临床使用要求的单克隆抗体,为CysC快速检测试剂盒的研发及新的CysC检测技术的发展奠定物质基础。方法:在GenBank数据库找到CysCcDNA序列(BC110305.1),根据大肠杆菌同义密码子偏好性优化后进行合成,合成的基因用EcoRI/XhoI双酶切后与经同样处理的PET-32a质粒连接,构建得到CysC表达载体PET32a-CysC。经鉴定后通过热激转化将构建成功的表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),在合适的条件下用IPTG诱导表达,经过Ni柱纯化后得到纯净的CysC蛋白。得到的蛋白经过SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用于免疫Balb/c小鼠,免疫三次后使用间接ELISA测定血清效价,效价达到融合要求后取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株,通过有限稀释法筛选能稳定分泌单克隆抗体的细胞株,筛选到的细胞株腹腔注射Balb/c小鼠制备腹水,用Protein A/G亲和纯化柱纯化腹水得到单克隆抗体。对得到的抗体进行效价、亲和力鉴定,用竞争ELISA验证抗体对临床血清样本的识别能力,筛选出符合临床使用要求的单克隆抗体。结果:成功构建了 PET32a-CysC表达载体,用IPTG诱导后的CysC蛋白以包涵体形式表达,经过纯化后得到了纯净的CysC重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot结果显示目的条带清晰、位置正确。当小鼠免疫效价达到1:128000后,取脾与骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法2次克隆化后筛选得到4株阳性细胞株,命名为4G5B5、4G5B6、4G5A7、4G5F11。将筛选到的4株细胞分别注射到小鼠腹腔用于制备腹水,用Protein A/G亲和纯化柱纯化后得到单克隆抗体,效价分别为1:256000、1:512000、1:256000、1:64000,亲和力分别为 4.15×106、4.26×106、3.98×106、2.07×106L/mol。使用竞争 ELISA 检测临床血清样本的结果显示这4株抗体均能识别血清样本中的抗原,能够用于临床血清样本的检测。结论:通过原核表达和纯化得到了纯净CysC重组蛋白;制得了 4株CysC单克隆抗体,且均能够用于临床血清样本中天然CysC蛋白的检测。