基于核酸适配体的侧流层析试纸条快速检测真菌毒素研究

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真菌毒素对人体健康具有巨大危害,寻求快速、高灵敏的真菌毒素检测技术一直是食品安全领域的研究热点。核酸适配体是通过指数富集的配基系统进化技术从随机核酸文库中产生的DNA或RNA单链,可以折叠成具有高特异性和亲和力的高级结构来识别特定靶标。本研究将侧流层析技术和适配体结合,采用适配体互补链竞争方式建立了B族黄曲霉毒素的试纸条检测方法和同时快速检测赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)的多残留试纸条检测方法;利用自制的固相萃取(SPE)柱对样品实现了一步净化,为快速检测真菌毒素提供了理论基础和技术支持。主要研究内容如下:1.制备了一种适用于真菌毒素提取净化的SPE柱。将样品提取液通过SPE柱,通过优化提取试剂和净化条件,实现了OTA和B族黄曲霉毒素等毒素污染样品的一步净化。结果表明,使用该SPE柱的OTA和B族黄曲霉毒素的回收率为92.4%-102.9%,相对标准偏差(RSD)为1.0%-4.3%。利用该SPE柱,可使样品的前处理极大提高了效率,有利于实现真菌毒素的快速检测。2.建立了一种B族黄曲霉毒素的荧光侧流层析试纸条检测方法。该方法在已有的核酸适配体基础上,基于B族黄曲霉毒素与适配体的互补DNA之间的竞争,使用荧光染料Cy5作为适配体的标记,通过优化适配体的长度和浓度、检测线(T线)处的互补探针、缓冲液类型和离子浓度以及有机溶剂的比例等关键影响因素以提高检测B族黄曲霉毒素的灵敏度。首次将适配体的互补链用作T线构建B族黄曲霉毒素适配体试纸条,实现B族黄曲霉毒素的快速定量检测。该方法定量检测B族黄曲霉毒素的线性范围为0.2-20 ng/m L,检出限为0.16 ng/m L,且特异性良好。在花生、杏仁和无花果干等样品中的加标回收率为93.3%-112.0%,RSD为2.7%-7.9%,该结果与HPLC-MS/MS方法准确性一致。该方法具有成本低、分析速度快和操作方便等优点,为现场快速检测B族黄曲霉毒素提供了新型的快速检测技术,具有良好的应用前景。3.建立了一种OTA和AFB1同时检测的核酸适配体多残留试纸条方法,该方法基于OTA和AFB1与适配体互补链竞争结合两种适配体,通过优化适配体的浓度以及缓冲体系的p H值,提高了同时检测OTA和AFB1的灵敏度和准确性,实现了OTA和AFB1的同时快速定量检测。该方法在OTA和AFB1的浓度分别为0.5-50 ng/m L时具有良好的线性关系,相关系数R2分别为0.9887和0.9910,检出限分别为0.51 ng/m L和0.38 ng/m L,检测结果的特异性良好。通过对花生和葡萄干等样品中加标回收,结果表明OTA和AFB1的回收率分别为82.1%-109.7%和83.3%-110.1%,RSD为1.9%-8.2%。经与HPLC-MS/MS方法比对实验证明该方法的准确性良好。该方法操作简单、灵敏度高,为真菌毒素OTA和AFB1的同时检测提供理论依据和技术支撑。
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