马铃薯StPTF1基因的功能鉴定

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植物转录因子bHLH(basic Helix-Loop-Helix)在植物生长和发育的调节以及环境胁迫的响应等生物过程中起着重要的调控作用。磷转录因子(Phosphate Transcription Factor1,PTF1)属于bHLH家族,它有效地参与了植物对磷酸盐胁迫的适应性生长。目前,在水稻(Oryza sativa),大豆(Glycine max)和玉米(Zea mays)中PTF1基因的功能已有研究报道,但对马铃薯(Solanum tuberosum L.)StPTF1基因的研究较少。本研究通过本地序列基本检索工具(Basic local alignment search tool,BLAST)比对,得到了马铃薯StPTF1基因完整的mRNA核苷酸序列,然后对基因结构和功能进行了分析和鉴定。取得了以下研究结果:1.通过同源比对,得到了马铃薯StPTF1基因完整mRNA序列,GenBank数据库登记号为No.XM006351155.2,开放阅读框(ORF)序列全长1083 bp,编码360个氨基酸残基,其分子量为39.68 KDa,等电点是5.92。使用Clustal X和MEGA6.0对StPTF1基因的进化关系进行分析,发现其在进化上是比较保守的。通过对蛋白质特性的预测发现,StPTF1为亲水性蛋白,不具备跨膜结构。2.利用同源重组的方法构建了绿色荧光蛋白(GFP)标记的StPTF1基因瞬时表达载体pEGFP-StPTF1。通过烟草叶片的侵染试验发现,被标记的马铃薯StPTF1基因在细胞核中表达。使用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术,对磷酸盐胁迫条件下不同时间点(0、3、6、9、12、24、72和120 h)StPTF1基因在根、茎、叶中的表达模式进行定量分析,结果表明:马铃薯StPTF1在各组织中均有表达而且表达水平受胁迫时间影响存在丰度差异,根中表达量明显高于茎和叶。另外,当植株被低磷胁迫3 h后,StPTF1基因在根、茎、叶中表达量均明显提高,在根中表达差异最显著,而在6、12和72 h时,茎和叶中没有表达差异。3.用StPTF1基因过表达载体pBI121-StPTF1和干扰表达载体pCPB121-StPTF1分别对马铃薯品种“Desireé”微型薯进行遗传转化,用卡纳霉素抗性生根筛选和转基因植株中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因的PCR检测,分别得到了4株过表达和3株干扰表达转基因植株。4.用qRT-PCR的方法对7株低磷胁迫处理的转基因植株在0、1和15 d的StPTF1基因表达水平进行分析,发现4株过表达转化植株中,StPTF1基因的表达量会随胁迫时间的延长而增加,各转基因植株间存在表达差异;此外,StPTF1基因在3株干扰表达植株中表达量无显著差异。
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