横纹肌溶解致急性肾损伤肾小管细胞的凋亡机制

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目的:探讨肌红蛋白是否能引起小管细胞凋亡及其凋亡途径。方法:(1)以不同浓度的维生素C还原100umol/L肌红蛋白,Mb与VitC的比例分别为1:0.63;1:1.25;1:2.5;1:5;1:10;1:15,利用分光光度计测量VitC还原肌红蛋白的最佳浓度。(2)设定单纯Mb组、Mb+VitC组、VitC组(Mb 200umol/L,Vit C 2 mmol/L)、Con组,刺激HK2细胞时间为分别0h,24h,48h,96h,通过MTT法来检测增殖情况,使用自动生化分析仪测量LDH值。(3)按照不同浓度还原态肌红蛋白分组,分组如下:Mb 200uM+VitC2mM组、Mb 100uM+VitC1mM组、Mb 50uM+VitC500uM组、Mb 25uM+VitC 250uM组、Mb 12.5uM+VitC 125uM组、Con组,刺激HK2细胞时间分别为0h、24h、48h、96小时,通过MTT法来检测HK2细胞增殖情况,使用自动生化分析仪测量LDH值。(4)流式细胞仪检测正常培养基(Con)组及Mb 200uM+VitC 2mM组,刺激HK2细胞48h后细胞凋亡情况。(5)以Mb 200uM+VitC 2mM为刺激物,根据刺激时间分为7组,分别为0h(Con)组、3h组、6h组、12h组、24h组、36h组、48h组,检测蛋白质水平GRP78、CytC、Caspase 9、Caspase 8、Caspase4/5。结果:(1)当Mb与VitC浓度比为1:10时,在分光光度计检测还原态继红蛋白的620nm处达高峰。(2)Mb+VitC组细胞增殖能力较Con组明显降低,Mb+VitC组LDH较Con组升高。(3)Mb 200uM+VitC 2mM组细胞增殖能力较Con组明显降低,Mb 200uM+VitC 2mM组LDH较Con组升高。(4)流式细胞仪检测Mb 200uM+VitC 2mmM组凋亡早期细胞百分数较正常培养基(Con)组显著增高。(5)GRP78蛋白水平表达在3h、6h、12h、24h组较Con组显著增加,CytC蛋白水平表达在12h、24h、36h、48h组较Con组显著增加,Caspase9蛋白水平表达在6h、12h、48h组较Con组显著增加,Caspase8、4/5蛋白水平表达无明显变化。结论:(1)维生素C可以还原肌红蛋白且维生素C与肌红蛋白的浓度比例为10:1时,可将肌红蛋白充分还原。(2)在细胞内起损伤作用的肌红蛋白为还原态。(3)200umol/L还原态肌红蛋白刺激48h可以引起HK2细胞凋亡。(4)肌红蛋白刺激通过线粒体途经引起细胞凋亡。
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