原发性肝癌在全世界恶性肿瘤发病率中占第五位,癌症相关死亡率中占第三位；而我国原发性肝癌的发病率和死亡率远高于其他国家,在恶性肿瘤发病率中占第三位,恶性肿瘤死因排位中占第二位。大部分肝癌患者发现时已为晚期,需要进行全身治疗,包括全身化疗和靶向治疗；然而全身化疗对肝癌患者的治疗效果并不理想,主要原因在于肿瘤细胞的耐药和患者不能耐受化疗的毒副反应。为了减轻化疗药物的毒副作用和增加药物的疗效,对药物进行分子修饰,使其能够在患者体内靶向作用于肿瘤组织是目前研究的一个方向。目前用于原发性肝癌的化疗药物中,阿霉素(DOX)是最为常见药物之一,但大剂量的阿霉素治疗将给患者带来严重的毒副反应,如血液毒性、胃肠道反应、肝肾毒性,特别是对心脏的毒性。Cathepsin B (Cat B)是位于溶酶体中的一种蛋白酶,在肿瘤细胞中常呈高表达,有促进肿瘤细胞侵袭和转移的作用。并且Cat B可特异酶解Phe-Lys二肽,在靶向抗肿瘤新药研发中,Cat B有望成为一个潜在的分子靶点。为此,Dubowchik等设计了一个针对Cat B的阿霉素前体药物PDOX,其结构式为Ac-Phe-Lys-PABC-DOX, PABC的作用是为了增加DOX和Phe-Lys的空间距离,以利于Phe-Lys与Cat B的接触。在血循环和正常组织中,几乎无Cat B的表达,前体药物以非活性存在；当药物进入肿瘤等富含Cat B的组织时,Phe-Lys二肽被Cat B裂解,暴露的PABC部分可迅速自行水解,释放出活性的DOX,因此药物对富含Cat B的癌组织具有靶向性,而对正常组织的毒副作用减轻。本课题组先前用新药PDOX治疗胃腹膜转移癌的动物模型研究中,发现PDOX对抗癌转移有明显的疗效,为了验证PDOX对肝癌的治疗效果,我们设计了PDOX治疗高转移性肝癌裸鼠原位移植模型的实验。第一部分：PDOX对高转移性肝癌裸鼠原位移植模型的疗效研究目的：比较PDOX与DOX对高转移性肝癌裸鼠原位移植模型的疗效。方法：在细胞培养室将HCCLM9细胞培养至对数生长期,收集细胞后,取适量注射入2只裸鼠肩部皮下,当肿瘤生长至1cm左右时,手术取出皮下种植瘤,将肿瘤切成1mm3,手术植入33只雄性裸鼠肝脏。术后观察裸鼠伤口和肿瘤生长情况。在第8天,裸鼠被随机分为三组,分别为Control组10只、DOX组11只和PDOX组12只,通过尾静脉注射分别给予等体积的生理盐水、DOX和PDOX,每8天给1次药,每4天称1次体重,在实验终点,全部裸鼠行腹部MRI检查,后行安乐死,取血标本行肿瘤标志物AFP检查；解剖裸鼠,详细记录解剖所见,测量肝脏肿瘤重量和体积,计算荷瘤比,按ePCI评分标准进行评分；对各主要组织和脏器行组织病理学检查,观察肺转移和其他转移情况。结果：至实验终点,PDOX组和DOX组动物体重均有轻微的下降,但PDOX组较DOX组小鼠一般状况更好；从D30至D36,由于肝肿瘤负荷过重和腹水,导致对照组体重上升。在实验终点,所有裸鼠行腹部MRI检查以获得代表性的影像。与对照组比较,PDOX和DOX治疗组肿瘤重量分别降低了43.6%和42.0%,同时肿瘤体积分别缩小了53.4%和49.1%(P<0.01,DOX/PDOX vs Contro1)。荷瘤率在PDOX组18.10%、DOX组18.28%、对照组27.94%(P<0.001,DOX/PDOX vs Control);AFP水平和ePCI值在PDOX组和DOX组均显著低于对照组(P<0.05,DOX/PDOX vs Control);另外腹膜后淋巴结转移率在对照组为80%(8/10)、DOX组27.3%(3/11)、PDOX组16.7%(2/12)(P<0.05,DOX/PDOX vs Control),但PDOX组与DOX组没有统计学差异；三组的肺转移率有显著的统计学差异,PDOX组肺转移率最低,为33.3%(4/12),其次为DOX组63.6%(7/11),对照组最高,为100%(10/10),(P<0.05,Control vs DOX；P<0.05, Control vs PDOX;P<0.05,DOX vs PDOX)。结论：在治疗肿瘤局部和区域转移中,PDOX与DOX有相似的疗效；在抗肿瘤远处转移中,PDOX显著优于DOX。第二部分：PDOX对高转移性肝癌裸鼠原位移植模型的毒性研究目的：比较PDOX与DOX治疗高转移性肝癌裸鼠原位移植模型的毒副反应。方法：在D36,动物行安乐死,取血放入KX-21型自动血常规分析仪内行血常规检查；部分血离心后取血清放入Aeroset自动血生化分析仪内检查,包括肝功能指标ALT、AST、DBIL、TBIL、GGT,肾功能指标BUN、Cr,心功能指标CK、CK-MB、LDH,电解质指标K+、Na2+、Ca2+、Mg2+、Cl-。结果：在外周血常规结果中,PDOX组白细胞水平显著高于DOX组(1.98倍,P<0.05)：与对照组相比,PDOX组血小板最高(1.67倍,P<0.05),其次为DOX组(1.59倍,P<0.05)；红细胞和血红蛋白在3组间没有统计学差异。在肝功能指标中,与对照组比较,DOX和PDOX组GGT和AST水平均显著降低(P<0.05,DOX/PDOX vs Control);而ALT、TBIL、DBIL在3组间没有统计学差异。在肾功能检查结果中,BUN水平PDOX组最低,其次为DOX组(P<0.001,Control vs DOX; P<0.05, Control vs PDOX; P<0.05, PDOX vs DOX); PDOX组Cr水平显著低于DOX组和对照组(P<0.05,PDOX vs Control；P<0.05,PDOX vsDOX)。电解质结果显示PDOX组CI-显著低于对照组(P<0.05),但PDOX组Ca2+显著高于DOX组和对照组(P<0.05,PDOX vs Control；P<0.05,PDOX vsDOX)。在心功能检查中,PDOX组和DOX组较对照组显著降低LDH(P<0.05,DOX/PDOX vs Contro1),但PDOX组和DOX组没有统计学差异；虽然与对照组比较没有统计学差异,但DOX组CK、CK-MB呈上升趋势,而且PDOX较DOX显著降低CK(P<0.05)；心肌组织病理学显示在DOX组心肌有参差不齐的退行性改变,在PDOX组和对照组无此改变。结论：与DOX比较,PDOX显著降低血液、肾毒性,尤其是降低了心脏毒性。第三部分：PDOX治疗高转移性肝癌裸鼠原位移植模型的作用机制研究目的：研究阿霉素前体药物PDOX靶向治疗高转移性人肝癌裸鼠原位移植模型的疗效机制。方法：所有动物的肝脏肿瘤行免疫组化检测Cat B、Ki-67、CD34、 VEGF、E-cadherin和D2-40的表达。新鲜的肿瘤组织放入RIPA裂解液,在低温下手动搅拌,后在离心机下去除细胞和胞核碎片,用BCA试剂盒行蛋白浓度检测,用Western Blotting检测蛋白中p-ERK1/2、ERK1/2、BCL-2、caspase-3、caspase-9和β-actin的表达。结果：根据细胞膜、细胞浆或细胞核着色程度评价免疫组化结果。在所有病例中,Cat B呈中-强度表达于胞浆,Ki-67表达位于胞核,VEGF阳性细胞着色位于胞浆和胞核,E-cadherin表达主要位于细胞膜和细胞浆,CD34和D2-40阳性细胞着色于细胞浆。以阳性率评价Ki-67的表达,用微血管密度和微淋巴管密度评价CD34和D2-40的阳性表达。在3组中所有肝脏肿瘤Cat B均呈阳性表达,阳性率100%;Ki-67阳性率在对照组为77.1±7.8%、DOX组为72.3±4.9%、PDOX组为61.6±14.6%,三组阳性表达率有显著的统计学差异(P<0.05, Control vs DOX; P<0.05, Control vs PDOX; P<0.05, DOX vs PDOX);CD34中位微血管密度值在对照组为47.2(21.4-70.0)、DOX组为60.9(37.0-91.2)、PDOX组为55.6(22.2-80.2),3组无统计学差异(P>0.05)；VEGF和E-cadherin的阳性表达率在3组间均无统计学差异(P>0.05)；D2-40中位微淋巴管密度值在对照组、DOX组和PDOX组分别为0.5(0.0-3.2)、1.8(0.0-8.4)和1.8(0.0-5.8),3组无统计学差异(P>0.05)。Western Blotting结果显示：PDOX和DOX组ERK、caspase-3、caspase-9和β-actin呈高表达,p-ERK、BCL-2呈低表达,PDOX通过抑制ERK磷酸化,减少BCL-2表达,从而激活caspase-3和caspase-9发挥抗肿瘤作用。结论：与DOX比较,PDOX可更好的抑制肿瘤细胞增殖；PDOX至少可通过ERK通路发挥抗肿瘤作用。