研究背景胰腺癌是一种临床发现晚、恶性程度高和预后差的消化系统恶性肿瘤。流行病学资料表明,胰腺癌的5年总体生存率在7%以下,分别位居美国和我国恶性肿瘤死亡原因的第四位和第六位,并呈上升趋势。手术切除是目前临床上唯一可能治愈胰腺癌的方式,但根治性手术切除率仅为15-20%,绝大多数患者在初次就诊时因肿瘤局部晚期或发生远处转移已失去手术机会。化疗是改善局部进展期及转移性胰腺癌患者预后的重要治疗手段,然而胰腺癌患者易发生化疗耐药,以吉西他滨为基础的单药或联合用药方案并没有大幅延长患者的总体生存时间。因此,寻找新的分子标记物以提高胰腺癌的早期诊断率、深入探索耐药的分子机制以提高胰腺癌的药物治疗效果,对于改善胰腺癌患者预后具有重要的意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸而不能编码蛋白质的RNA,以其丰富的基因表达调控手段,在肿瘤的发生、发展、增殖、凋亡、侵袭、转移、自噬、化疗耐药、干细胞维持及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）等多个方面发挥重要的调控作用。同时,鉴于lncRNA自身表达上的丰富性和组织表达上的特异性,肿瘤中表达失调的lncRNA可作为肿瘤早期诊断和预后判断的分子标志物。研究表明lncRNA在胰腺癌中表达失调,并参与胰腺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移、自噬、干细胞维持及上皮间质转化等多种肿瘤生物学表型的调控。但是其在胰腺癌化疗耐药中的调控作用及机制仍不完全明确。因此,深入研究lncRNA在胰腺癌化疗耐药中的调控作用和机制,对于揭示胰腺癌化疗耐药的分子机制具有重要的意义。研究目的检测lncRNA在胰腺癌吉西他滨耐药细胞株及亲本株中的表达差异,构建胰腺癌耐药相关的竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络;筛选调控网络中潜在关键性lncRNA,初步探索潜在关键性lncRNA调控胰腺癌细胞化疗耐药作用及机制;并检测潜在关键性lncRNA在胰腺癌组织中的表达,评估其与预后的价值。研究方法通过高通量基因芯片检测胰腺癌吉西他滨耐药细胞株AsPC-1/GR和亲本株AsPC-1中lncRNA、mRNA及microRNA的表达差异,建立耐药相关lncRNA表达谱;通过生物信息学分析,构建胰腺癌耐药相关的竞争性内源性RNA调控网络;筛选调控网络中潜在关键性lncRNA,并预测其参与调控化疗耐药的可能作用及机制;选取预测的潜在关键性lncRNA作为研究对象,利用原位杂交技术检测其在180例临床手术标本中的表达,评估潜在关键性lncRNA的表达水平与患者预后的相关性;在胰腺癌细胞中上调/下调潜在关键性lncRNA的表达水平,采用CCK-8法、流式细胞术、Transwell法等探索潜在关键性lncRNA对胰腺癌细胞化疗敏感性、增殖、凋亡、侵袭及迁移等的调控作用;构建稳定过表达的潜在关键性lncRNA的胰腺癌细胞株,建立裸鼠移植瘤模型,评估其在体内对肿瘤生长和化疗药物治疗的作用;通过RNA结合蛋白免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因实验探索潜在关键性lncRNA调控化疗耐药的机制及其作用的靶基因,Western blot检测关键性lncRNA及其靶基因所调控信号通路的变化情况。研究结果1、胰腺癌吉西他滨耐药相关lncRNA表达谱的建立通过高通量lncRNA芯片检测,发现在胰腺癌吉西他滨耐药株AsPC-1/GR和其亲本株AsPC-1之间有1897个耐药相关lncRNA存在表达差异（fold change>1.5,P<0.05）,其中963条lncRNAs表达升高和934条lncRNAs表达降低,而长链非编码RNA谷胱甘肽-S-转移酶μ3转录本2（Homo sapiens glutathione S-transferase mu 3,transcript variant 2,non-coding RNA,NR₀24537.1,GSTM3TV2）呈显著性表达升高（fold change>104.52）;并以此构建了胰腺癌耐药相关的竞争性内源性RNA调控网络。2、生物信息学分析结果通过对耐药相关的竞争性内源性RNA调控网络进行分析,发现lncRNA GSTM3TV2在调控网络为潜在关键性lncRNA,其可能通过竞争性内源性RNA机制,竞争性结合let-7,调节网络中GLO1、KLK6、LAT2、OLR1及PARM1等的表达,从而介导胰腺癌化疗耐药的发生。3、LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌组织中的表达检测通过原位杂交法检测lncRNA GSTM3TV2在180例胰腺癌组织及癌旁组织中的表达,发现GSTM3TV2在胰腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P=0.000）;而GSTM3TV2主要在细胞浆表达,细胞核未见表达。胰腺癌组织中GSTM3TV2的表达水平与肿瘤的N分期（P= 0.007）和TNM分期（P= 0.003）存在显著相关性。单因素生存分析,发现GSTM3TV2的表达水平（P=0.004）、肿瘤分化程度（P= 0.035）、T分期（P= 0.008）、N分期（P= 0.000）及TNM分期（P= 0.000）与患者预后相关。多因素生存分析发现,肿瘤分化程度（Low）、TNM分期（Ⅱ/Ⅲ）及组织GSTM3TV2表达水平（High）是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素（P 值分别为 P=0.008,HR=1.706,95%CI:1.147-2.537;P=0.003,HR=2.786,95%CI:1.149-5.470;P=0.036,HR=1.466,95%CI:1.025-2.096）。4、LncRNAGSTM3TV2对胰腺癌细胞恶性表型的调控作用体外实验发现,在胰腺癌细胞AsPC-1、MIAPaCa-2中上调GSTM3TV2可降低胰腺癌细胞对吉西他滨及白蛋白紫杉醇的化疗敏感性,减少吉西他滨及白蛋白紫杉醇诱导发生的细胞凋亡,并促进胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移,抑制细胞凋亡等;反之,在胰腺癌细胞AsPC-1/GR、MIAPaCa-2/GR中抑制GSTM3TV2的表达则观察到相反的实验结果（P<0.05）。体内实验发现,稳定过表达GSTM3TV2的实验组促进肿瘤的生长和降低肿瘤对吉西他滨及白蛋白紫杉醇治疗的敏感性（P<0.05）。5、LncRNA GSTM3TV2调控let-7的表达介导胰腺癌细胞化疗耐药实时定量PCR检测发现,在胰腺癌细胞中上调或下调GSTM3TV2的表达后可显著抑制或促进胰腺癌细胞中let-7的表达（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验发现共转染let-7 mimics和let-7结合位点野生型的GSTM3TV2载体质粒显著降低293A细胞中的荧光素酶活性（P<0.05）,而共转染let-7 mimics和let-7结合位点突变型的GSTM3TV2载体质粒对荧光素酶活性无影响,间接证明GSTM3TV2可与let-7相结合。RNA结合蛋白免疫沉淀实验发现,与对照组及转染let-7结合位点突变型GSTM3TV2载体质粒组相比,在胰腺癌细胞中转染let-7结合位点野生型GSTM3TV2载体质粒组中let-7的表达显著升高（P<0.05）,直接证明GSTM3TV2可与let-7相结合。Western blot检测显示,在胰腺癌细胞中上调或下调GSTM3TV2的表达后上调或下调let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2的表达水平,进一步说明GSTM3TV2可调控胰腺癌细胞中let-7的表达水平。同时,在稳定过表达GSTM3TV2的胰腺癌细胞中促进let-7的表达,可显著增加胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性（P<0.05）,并显著增加细胞对吉西他滨诱导发生的凋亡（P<0.05）,抑制let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2等的表达,说明LncRNA GSTM3TV2调控胰腺癌细胞化疗敏感性依赖于let-7的表达水平。6、LncRNAGSTM3TV2调控LAT2、OLR1的表达介导胰腺癌细胞化疗耐药Real time PCR检测发现,在胰腺癌耐药细胞中下调GSTM3TV2的表达后可显著抑制胰腺癌细胞中LAT2、OLR1 mRNA的表达（P<0.05）。Western blot检测显示,在胰腺癌细胞中上调或下调GSTM3TV2的表达后可促进或抑制胰腺癌细胞中LAT2、OLR1在蛋白水平的表达。双荧光素酶报告基因实验证实LAT2、OLR1为let-7的下游靶基因（P<0.05）,说明GSTM3TV2可通过竞争性结合let-7,从而调控LAT2、OLR1的表达。而在胰腺癌细胞中抑制LAT2、OLR1的表达后,可增加细胞对吉西他滨的化疗敏感性（P<0.05）和增加细胞对吉西他滨诱导发生的凋亡（P<0.05）,说明LAT2、OLR1可调控胰腺癌细胞的化疗敏感性。同时,在GSTM3TV2稳定过表达细胞中抑制LAT2、OLR1的表达,可增加细胞对吉西他滨的化疗敏感性（P<0.05）和增加细胞对吉西他滨诱导所发生的凋亡（P<0.05）,而Western blot检测结果显示过表达let-7可抑制GSTM3TV2稳定过表达细胞中LAT2、OLR1的表达,说明GSTM3TV2可调控LAT2、OLR1的表达介导胰腺癌细胞化疗耐药的发生。7、LncRNAGSTM3TV2 调控let-7 的表达激活 PI3K/Akt、MAPK 及 STAT3 信号通路Western blot检测显示,在胰腺癌细胞中AsPC-1、MIAPaCa-2上调GSTM3TV2的表达后,可以①激活K-Ras基因下游的PI3K/Akt信号通路,从而上调 p-mTOR、p-Akt、Bcl-xl、NF-κB、p-GSK-3β、p-Bad 和下调 cleaved caspase-9、p21、p27等表达,进而上调细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinE1、CDK6,和下调细胞凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3等的表达;②激活K-Ras基因下游的MAPK信号通路而上调c-Raf、p-c-Raf、p-ERK1/2等表达;③上调K-Ras基因下游蛋白分子Rac1、RhoA等表达;④上调EMT相关蛋白Vimentin、N-cadherin,、ZEB1、Snail及 Slug 等表达;⑤激活 STAT3 信号通路而上调p-STAT3的表达。反之,在胰腺癌细胞AsPC-1/GR、MIAPaCa-2/GR中抑制GSTM3TV2的表达则观察到相反的实验结果。8、LncRNAGSTM3TV2调控EGFR的表达降低胰腺癌细胞对厄洛替尼的敏感性Western blot检测显示在胰腺癌细胞中上调或下调GSTM3TV2的表达可抑制或促进EGFR的表达;而Real time PCR检测发现,在胰腺癌细胞中上调或下调GSTM3TV2的表达可促进或抑制EGFR mRNA的表达,说明GSTM3TV2调控EGFR在蛋白水平的表达是在翻译或翻译前水平。RNA结合蛋白免疫沉淀技术检测发现,GSTM3TV2可直接结合EGFR的mRNA以阻碍翻译过程,下调EGFR在蛋白水平的表达。而在胰腺癌细胞中上调或下调GSTM3TV2的表达可降低或增加胰腺癌细胞对厄洛替尼的化疗敏感性（P<0.05）,和抑制或促进细胞对厄洛替尼诱导产生的凋亡（P<0.05）。同时,在GSTM3TV2稳定过表达细胞中促进EGFR的表达,可显著增加胰腺癌细胞对厄洛替尼的敏感性（P<0.05）和细胞对厄洛替尼诱导发生的凋亡（P<0.05）,而Western blot显示在上调EGFR的表达可拮抗GSTM3TV2对EGFR产生的抑制作用,说明LncRNA GSTM3TV2抑制EGFR的表达介导胰腺癌细胞对厄洛替尼耐药的发生。结论长链非编码RNA GSTM3TV2可通过竞争性内源性RNA机制,竞争性结合let-7,上调 let-7 的靶基因 K-Ras、c-Myc、HMGA2、LAT2 及 OLR1 等表达,并激活PI3K/Akt、MAPK及STAT3信号通路,从而参与胰腺癌细胞对吉西他滨化疗耐药的调控。LncRNA GSTM3TV2还可调控EGFR的表达,从而介导胰腺癌细胞对厄洛替尼的耐药。LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌组织中表达升高,GSTM3TV2表达升高是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素。