论文部分内容阅读
研究背景与目的喉鳞状细胞癌（Laryngeal Squamous Cell Carcinoma,LSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤,严重危害患者的健康及生活质量。目前,包括LSCC在内的肿瘤患者的治疗方案和预后评估主要是根据美国癌症分期联合委员会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）制定的 TNM（Tumour-Node-Metastasis）分期系统及组织学分级。然而,临床实践中却常存在相同的TNM分期、组织学分级的LSCC患者预后结果却截然不同的情况。因此,迫切需要寻求更有效评估LSCC预后和指导治疗方案的新方法。肿瘤与其微环境密切相关,相互作用及影响。有研究发现肿瘤微环境中浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes,TILs）及肿瘤免疫微环境中的T细胞数量与肿瘤的预后相关。基于T细胞的免疫评分已在多种肿瘤中被证实可以预测患者预后,其效果甚至优于传统的TNM分期。课题组前期对免疫球蛋白G4（Immunoglobulin G4,IgG4）与肿瘤的研究中发现多种肿瘤微环境中可能存在由IgG4介导的免疫抑制和肿瘤免疫逃逸,但目前关于LSCC的免疫评分研究报道少见,也未有关于免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）介导的以B细胞为主的体液免疫与LSCC关系的研究报道。本课题拟通过观察TILs、T细胞及IgG4+浆细胞在LSCC组织中的分布特征并分析探讨它们与LSCC临床病理特征及患者生存时间等的相关性,为预测LSCC预后的病理评估指标提供临床实验研究依据。实验材料与方法1.收集并整理汕头大学医学院第一附属医院2007年6月-2019年12月期间接受切除手术、有完整TNM分期信息、同时含有肿瘤组织和肿瘤旁组织的喉原发性鳞状细胞癌石蜡标本57例,同一病例在光镜下挑选有较多炎症细胞浸润的石蜡组织作为研究样本。2.统一使用樱花自动染色机Tissue Tek DRS（SAKURA）将每个病例的第一张实验切片进行H＆E染色。3.IgG4阳性浆细胞及T、B细胞相关标记物的免疫组织化学检测:统一使用全自动多功能免疫组化染色仪BenchMark XT（VENTANA/Roche）中设置的免疫组化标准化染色程序（XT OptiView DAB IHC v4）对每个喉鳞状细胞癌病例的石蜡组织切片（厚度3 μm）进行各项指标检测,包括抗IgG4、CD3、CD4、CD8、CD38、CD79α抗体。一抗抗体均为临床批准使用的诊断级别单克隆抗体,各项指标检测均设置严格的阳性和阴性对照。4.使用病理切片扫描仪（Pannoramic Scanner 2.1.1）及配套扫描软件对所有免疫组化切片及H＆E染色切片进行扫描并生成对应病理数字切片。5.使用CaseViewer 2.3.0病理数字切片浏览器对实验数字切片进行图象分析,将每个病例的肿瘤及瘤旁划分为不同区域,并分别对免疫组化指标阳性细胞进行人工计数。6.用IBM SPSS Statistics 26统计软件进行数据分析,spearman相关分析各指标阳性细胞数量之间以及与临床分期之间的关系;Kruskal-Wallis H检验比较不同区域间IgG4阳性细胞数量;Kaplan-Meier生存分析比较各免疫细胞指标高浸润组和低浸润组患者的总生存时间（overall survival,OS）和TILs高、中、低浸润组患者的OS;COX多因素分析预后的独立影响因素。本研究中P＜0.05认为有统计学意义。实验结果1.肿瘤N分期影响患者生存时间,N分期低的患者生存时间长于N分期高的患者,在Kaplan-Meier分析中有统计学意义（P=0.002）。2.LSCC肿瘤TC间质中常见多量TILs浸润,其中高TILs组占45.6%（26/57例）,中等TILs组占45.6%（26/57例）,低TILs组仅占8.8%（5/57例）。高、中TILs组患者中位生存时间长于低TILs组,其中高、中TILs组患者中位生存时间分别是92个月（95%CI,15.732-168.268）和90个月（95%CI,24.467-155.533）,低 TILs 组中位生存时间仅为 21 个月（95%CI,16.199-25.801）。3.CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞数量在TC肿瘤间质内相互之间均呈正相关关系（r=0.667,P＜0.001;r=0.782,P＜0.001;r=0.624,P＜0.001）;在 TC 肿瘤巢中也互为正相关（r=0.441,P=0.001;r=0.833,P＜0.001;r=0.326,P=0.013）。4.TC肿瘤巢与IM中的CD3+T细胞数量与患者T分期呈负相关（r=-0.270,P=0.042;r=-0.427,P=0.001）;TC肿瘤巢与IM中的CD3+T细胞数量也与临床分期呈负相关,但仅在IM中有统计学意义（r=-0.236,P=0.077;r=-0.387,P=0.003）。5.IM以外500 μm近瘤旁组织的IgG4+浆细胞数量明显低于TC的肿瘤间质和IM,差异有统计学意义（H=-81.428,P＜0.001;H=-83.826,P＜0.001）。TC肿瘤间质内IgG4+浆细胞数量与CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞数量之间均呈正相关关系（r=0.315,P=0.017;r=0.397,P=0.002;r=0.267,P=0.045）。IgG4+与CD38+浆细胞数量比值（IgG4+/CD38+）与临床分期呈负相关（r=-0.266,P=0.045）。结论1.TILs、CD3+T细胞及其主要亚群（CD4+T细胞及CD8+T细胞）的区域分布及数量可能是新的预测LSCC预后的病理评估指标。2.联合检测LSCC中TILs、T细胞及IgG4+浆细胞的数量有助于建立新的肿瘤免疫评分。