氮是植物生长发育过程中必不可少的营养元素之一,而尿素CO(NH2)2不仅是农作物生产中土壤施用氮肥的主要形式,而且是植物体内氮素新陈代谢的主要产物。目前,高等植物从外界环境吸收尿素的过程主要有高亲和性尿素转运蛋白DUR3介导的主动运输途径和低亲和性尿素转运蛋白MIPs介导的被动运输途径。高亲和性尿素转运蛋白DUR3家族相关研究在拟南芥、水稻、玉米等植物中已有详细报道,而水孔蛋白MIPs家族除了具有高效跨膜转运水分子的功能外,还参与其它小分子营养物质如尿素的跨膜运输过程。与高亲和性尿素转运蛋白不同,在植物体内水孔蛋白不仅参与尿素的转运过程,同时也在其它物质的运输途径中发挥重大作用。因此,分离鉴定高等植物体内的水孔蛋白并探究其在尿素等物质转运过程中发挥的生理功能,对探讨农业生产中合理施用尿素、提高氮肥利用效率具有基础性的研究意义。黄瓜是葫芦科重要的双子叶植物代表之一,其产量和品质均依赖于氮素等营养物质的合理施用。本文从植物分子生物学角度系统地对黄瓜水孔蛋白CsNIP2;1在尿素转运功能、转运特性、组织特异性表达、亚细胞定位以及诱导表达模式等方面进行探讨。结论如下：1.同源序列比较分析发现黄瓜基因组中水孔蛋白CsNIP2;1与南瓜尿素转运蛋白CpNIPl的同源性较高,生物信息学分析显示CsNIP2;1长867bp,编码288个氨基酸,拥有6个跨膜区域,两边的N端和C端均位于膜内,在跨膜区域之间存在两个分别位于细胞内和细胞外的NPA/NPA(V)保守区域；2.选用酵母尿素吸收缺陷型突变菌株,其在低浓度尿素作为唯一氮源条件下无法正常生长。CsNIP2;1的异源表达会让酵母突变体恢复正常生长,这一尿素转运过程会受到高pH条件的抑制作用。在渗透条件以及甘油存在的条件下,酵母功能互补检测显示CsNIP2;1不仅具有转运尿素的功能,还具有转运水的功能,但对甘油没有渗透性；3.利用转基因技术获得表达CsNIP2;1启动子的拟南芥植株,对转基因拟南芥幼苗以及成熟期的花、果荚等不同组织进行GUS化学染色,结果显示CsNIP2;1在根部和子叶中的表达量较高,在成熟组织的花萼和果荚中均有表达。采用实时定量PCR技术对黄瓜种子萌发时期CsNIP2;1的转录水平表达进行检测,同时对转化CsNIP2;1启动子的转基因拟南芥植株在种子萌发初期进行GUS组织化学染色分析,结果均显示CsNIP2;1在植株种子萌发初期表达量较高；4.根据蔗糖密度梯度离心原理建立黄瓜原生质体分离提取方法,构建原生质体重组表达载体CsNIP2;1-EGFP,分别分离提取黄瓜原生质体和拟南芥原生质体后,采用PEG转化方法进行基因瞬时表达。荧光显微镜下观察显示CsNIP2;1-EGFP发出的绿光出现在原生质体边缘,并且与细胞膜染料FM4-64发出的红光完全重合,结果证明CsNIP2;1定位于植物细胞膜上；5.采用实时定量PCR技术对不同外源氮源处理下的黄瓜根部进行转录水平上CsNIP2;1的诱导表达分析,同时采用相同的处理方式,对不同外源氮源条件下转化CsNIP2;1启动子的拟南芥植株进行GUS组织化学染色,两者结果均显示黄瓜CsNIP2;1分别会受到缺氮处理、尿素和硝酸盐诱导的上调表达；6.选用野生型拟南芥Wt和拟南芥尿素吸收缺陷型突变体atdur3-3, atdur3-3突变体在低浓度尿素作为唯一氮源生长条件下因无法吸收足够氮营养而出现缺氮表型。构建植物重组过表达载体csNIP2;1-Early102,利用转基因技术将CsNIP2;1分别转入Wt和atdur3-3,筛选获得过表达CsNIP2;1的纯合子转基因拟南芥植株,生长表型结果显示在低浓度尿素作为唯一氮源条件下,CsNIP2;1的表达不仅可以提高野生型拟南芥wt的生长状况,而且还可明显恢复拟南芥尿素吸收缺陷型突变体atdur3-3的缺氮生长表型,从而证明在植物体内CsNIP2;1呈现了尿素转运功能。以上研究结果证明黄瓜水孔蛋白CsNIP2;1是位于植物细胞膜上的尿素转运蛋白,在植物体内尿素循环代谢途径中发挥重要作用,即尿素由外界环境进入根部的吸收转运、种子萌发初期氮素活化和再利用过程中植物内源尿素的运输以及由根部向发育组织转运氮素的过程。