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目的1.研究aPC对PAN诱导的足细胞凋亡的影响。2.探索aPC抗足细胞凋亡的作用机制。3.探讨aPC和PAR-3下游信号通路在抗足细胞凋亡中的可能作用。方法1.用TUNEL凋亡试剂盒检测不同浓度aPC对PAN诱导的人足细胞凋亡的影响,同时在封闭抗体及Aptamer的干预下检测aPC抗凝血作用对足细胞凋亡的影响。2.应用RT-PCR, Western Blot,免疫荧光技术对足细胞相关基因(Thbd,PAR-1,PAR-2,PAR-3,PAR-4,EPCR)表达谱及蛋白质表达谱进行分析。3.运用相关受体特异激动剂及封闭抗体进行干预,筛选出参与aPC影响足细胞凋亡关键受体,进一步运用shRNAmir gene Knock Down技术证实筛选关键受体的正确性。4.在不同刺激下(aPC,TRAP-3,Thrombin),用荧光显微镜持续记录钙敏感的荧光染料(Fura-2 AM)标记的足细胞,检测细胞内钙离子的变化。5.借助免疫共沉淀技术研究相关受体作用的时效性。6.采用分子生物学技术构建表达V5指示蛋白标记的野生型PAR-3载体,用定点突变试剂盒构建PAR-3相关突变型载体并用其转染肾小球系膜细胞系,建立相应稳定转染细胞系检测aPC和PAR-3的相互作用以及对凋亡的影响。7.运用Western Blot,免疫共沉淀技术针对可能会参与aPC对凋亡调控的信号通路Caveolae, RhoA及ERK1/2等进行相关活性检测。结果1.aPC显著降低了PAN诱导的足细胞的凋亡,即使在0.2nM这样低的浓度仍具有显著的保护作用,此外利用封闭抗体HAAPC及Aptamer HSO2-88阻断aPC的抗凝功能对上述实验结果无显著性影响。2.体外培养的人足细胞在基因转录层面极强表达PAR-2,PAR-3及Thbd,而PAR-1和PAR-4表达量极低,更有趣的是EPCR表达缺失,Western Blot数据从其翻译的蛋白质层面进一步证实了上述结果。此外健康人肾脏活检冰冻切片双标免疫荧光检测确证了在体足细胞表达PAR-2, PAR-3而无EPCR表达。3.从对PAR-1,PAR-2,PAR-3,PAR-4特异激动剂及封闭抗体的研究中发现PAR-2及PAR-3是参与aPC影响足细胞凋亡关键受体,对采用shRNAmir gene Knock Down技术分别建立PAR-2及PAR-3Knock Down的稳转细胞系的研究中进一步肯定了PAR-2及PAR-3是参与aPC影响足细胞凋亡关键受体。4.在对足细胞胞内钙离子监测中发现aPC及PAR-3激动剂无法诱导胞内钙离子浓度的变化,只有对照组在Thrombin的诱导下于刺激后80秒左右产生一胞内钙离子峰值。5.免疫共沉淀结果显示PAR-2和PAR-3在aPC的刺激下形成异二聚体并呈时间依赖性,其聚合在刺激后10分钟时开始增加,然后随时间不断增加。在PAR-3封闭抗体的干预下PAR-2和PAR-3在aPC的刺激下无法形成异二聚体。6. RT-PCR结果显示PAR-2, PAR-3及其突变载体转染成功。aPC结合实验结果表明,PAR-3及其突变体均可以同aPC结合。在对aPC刺激后收集的细胞上清液的Western Blot分析过程中发现,在野生型和胞外段加TEM1穿膜及胞内段的突变载体稳转的细胞系上清中能检测到V5指示蛋白,而在cleavage site突变载体稳转的细胞系上清中没能检测到V5指示蛋白。转染PAR-3野生型或其突变型载体的研究中发现,肾小球系膜细胞只有转染PAR-3野生型载体才能在aPC的刺激下对抗staurosporine或高浓度葡萄糖诱导的凋亡。7.免疫共沉淀结果显示aPC刺激下调了Caveolin-1和PAR-2及PAR-3的结合,在用MβCD破坏Caveolea结构后aPC失去其调节作用。Western Blot结果显示磷酸化的Caveolin-1同总的Caveolin-1的比值随aPC的刺激时间增加而逐渐降低。此外aPC和PAR-2激动剂均无法抑制PAN诱导的Cavolin-1 gene Knock Down稳转足细胞的凋亡。抑制Ga i, EGFR及sphingosine receptor-1的活化对aPC的抗凋亡作用无影响,然而抑制RhoA及MEK1/MEK2的活化却让aPC抗凋亡作用消失。ERK1/2磷酸化及RhoA的活化均在aPC刺激10分钟后显著升高与Caveolin-1的去磷酸化过程一致。结论1. aPC有效降低PAN诱导的足细胞凋亡并独立于其抗凝血功能。2.人足细胞表达PAR-2和PAR-3, aPC能结合并裂解PAR-3, PAR-2和PAR-3及其异二聚体形成在aPC抗凋亡的调控中起关键作用。3. aPC抗凋亡作用需要Caveolea的协助并可能通过RhoA及ERK1/2进行下游信号通路的调控。本研究的创新点及意义：1.首次提出aPC的细胞保护功能在人足细胞依靠PAR-2和PAR-3相互作用,不同于目前普遍认同的PAR-1和EPCR传统作用模式,为进一步研究人足细胞相关疾病提供新的思路。2.在国际上首次发现aPC能结合并裂解PAR-3为进一步研究aPC及其同类受体的相互作用奠定基础。3.本研究发现aPC能有效抑制PAN诱导的足细胞的凋亡,提示aPC除其对重症败血症具有显著的疗效外,仍可能应用于各种急性肾脏疾病的治疗。