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目的:在肺腺癌细胞中筛选POLE2(DNA聚合酶εB亚基)基因的下游关键基因,进一步研究PLK1基因的增殖及凋亡功能,验证PLK1基因与POLE2基因的功能相关性,初步探索POLE2基因的作用机制,为阐明POLE2基因抗肿瘤作用的分子机制奠定基础。方法:(1)设计合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,包装完成慢病毒表达载体并感染肺腺癌A549细胞。(2)对照组(shCtrl组)及实验组(shPOLE2组)慢病毒转染的肺腺癌细胞72小时后于倒置荧光显微镜下拍照,初步筛选转染效率达到80%的细胞株,细胞状态正常即可进行下一步实验。(3)提取shCtrl组及shPOLE2组肺腺癌细胞总RNA,采用qPCR检测POLE2基因在mRNA水平的沉默效率。同时进一步应用免疫印迹法(Western blot)检测干扰靶点的有效性。(4)采用Trizol试剂盒对6个样品总RNA的进行抽提,样品质控合格后进入芯片实验:(1)差异基因的筛选标准:符合FDR(False Discovery Rate)<0.05和︳FC︳(︳Fold Change︳)>2,且P值<0.05。(2)分别绘制差异基因火山图、散点图及聚类图。(5)运用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)平台对差异基因进行综合生物信息学技术分析,在下游基因中筛选可能受POLE2基因调控的30个下游基因。(6)qPCR检测相对shCtrl组30个下游基因RNA水平的表达,筛选出POLE2基因沉默后,在30个基因中mRNA水平表达下调最明显的PLK1基因。(7)同样运用慢病毒转染联合RNA干扰技术在肺腺癌A549及NCI-1299细胞中沉默PLK1基因。(8)对照组(shCtrl组)及实验组(shPLK1组)慢病毒转染的肺腺癌细胞72小时后于倒置荧光显微镜下拍照,初步筛选转染效率达到80%的细胞株,细胞状态正常即可进行下一步实验。(9)Western blot分别在两株肺腺癌细胞中检测PLK1基因在蛋白质水平的沉默效率。(10)运用CCK-8法验证沉默PLK1基因对肺腺癌A549、H1299细胞增殖功能的影响。(11)运用流式细胞术验证沉默PLK1基因对肺腺癌A549、H1299细胞周期的影响。(12)运用流式细胞术验证沉默PLK1基因对肺腺癌A549、H1299细胞凋亡功能的影响。结果:(1)成功构建POLE2 siRNA慢病毒表达载体,感染肺腺癌A549细胞,筛选荧光显微镜下观察转染效率达80%的细胞株进行下一步实验。(2)qPCR和Western blot进一步证实POLE2基因在mRNA水平和蛋白水平被显著沉默。(3)6个样品质控均合格,基因芯片技术在A549细胞中筛选出POLE2基因沉默前后差异表达的基因935个,其中上调基因403个,下调基因532个,应用生物信息学分析技术从下游基因中筛选出30个可能受POLE2基因调控的30个下游关键基因。(4)qPCR进一步验证以上30个基因在mRNA水平的表达,结果示PLK1基因表达下调明显。(5)其次,成功构建PLK1 siRNA慢病毒表达载体,并感染肺腺癌A549、H1299细胞,荧光显微镜下观察两组细胞转染效率达80%。(6)Western blot进一步在蛋白水平定量检测PLK1基因的被成功沉默。(7)利用CCK-8绘制细胞增殖功能曲线,结果示沉默PLK1基因能显著抑制肺腺癌A549、H1299细胞的增殖;(8)利用流式细胞术检测肺腺癌A549、NCI-H1299细胞的细胞周期阻滞情况,结果示沉默PLK1基因组相对于对照组,S期细胞数量明显减少,G2/M期明显增加;(9)利用流式细胞术检测肺腺癌A549、NCI-H1299细胞凋亡,结果示沉默PLK1基因组凋亡率增加。结论:1.通过对POLE2基因下游关键基因的筛选,确定了下游关键基因PLK1基因,为POLE2基因的下游分子机制研究奠定了基础。2.沉默PLK1基因可诱导人肺腺癌细胞株A549和NCI-H1299凋亡及抗增殖作用,并引起肺腺癌细胞G2/M期阻滞,这与POLE2基因功能相一致,揭示了POLE2基因与PLK1基因具有功能相关性,为进一步功能回复实验提供依据。