前言前列腺癌(prostate cancer, PC)在欧美等国家发病率极高,死亡率在男性疾病中位居第二位,仅次于肺癌。近年来,PC的发病率在我国明显上升,且发病年龄正趋于年轻化。激素抑制治疗是目前最有效的治疗方法,PC早期无症状,多数病人就诊已属晚期,除了骨和淋巴转移,PC最主要的死因是激素依赖性前列腺癌(androgen dependent prostate cancer, ADPC)演变成激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostate cancer, AIPC),然而,AIPC对去势治疗和化疗无效,细胞继续生长,肿瘤停止退化。因此在PC的诊断和治疗上也有待于寻找新的作用靶点。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种基质细胞源性生长因子,HGF通过作用于细胞膜表面的特异性跨膜受体c-Met发挥生物学作用,如诱导肿瘤细胞的离散、增殖、转移、侵袭及血管形成等。近年来许多报道证实c-Met、HGF在前PC组织过度表达,与PC的转移、侵袭相关,PC病人血浆中的HGF水平明显升高,因此提出HGF与PSA联合做为PC诊断的新的重要指标。NK4是1997年Date等发现的一种新型的HGF拮抗剂,已经在体外实验中证实,NK4在浓度从10ng／ml到1000ng／ml范围内完全不产生任何生物学效应,但具有完全的HGF拮抗的作用。NK4与c-Met结合,可以竞争性地抑制HGF和c-Met的相互作用,影响HGF/c-Met系统的信号转导,从而抑制HGF所诱导细胞的增殖、运动和形态改变,但其本身不能诱导c-Met的酪氨酸磷酸化。NK4蛋白或NK4表达基因的注入,在多种不同类型肿瘤实验模型均能显示其具有抑制肿瘤侵袭、生长、转移和血管生成等作用。有研究证明HGF可以增强前列腺癌的侵袭能力。此外,HGF从旁分泌转变成自分泌可能是前列腺癌表型转换的重要原因。HGF及其拮抗剂NK4在前列腺癌发生发展的作用及其机制还有待于进一步研究。HGF与细胞膜上的受体c-Met结合,受体激活后,通过与之偶联的磷脂酶C(phospholipase C, PLC)水解磷酸肌醇二磷酸(phosphatidylinositol diphosphate,PIP2),生成三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)和二酰基甘油(diacylglycerol,DAG)。IP3作用于内质网或肌浆网导致Ca2+释放,钙池耗竭引起外Ca2+内流。DAG也可以直接激活受体操纵性钙通道(receptor operated calcium channels, ROCC),引起细胞外Ca2+内流。细胞内游离Ca2+升高,激活一些蛋白磷酸酶,使底物蛋白磷酸化,将外界信号级联放大,进入核内,影响DNA复制,导致细胞恶变及肿瘤细胞的增殖分化。细胞内Ca2+直接参与调控肿瘤的生长,侵袭,转移和分化。而发生于细胞膜上的促使Ca2+进入细胞内的机制尚不清楚。瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道家族对细胞起着稳定和调控作用,其表达升高促进恶性肿瘤的生长。TRPC通道是TRP的一个亚族,包括TRPC(1-7), TRPC6通道作为胞内钙信号产生的一个重要途径,调节着第二信使Ca2+的浓度及各种蛋白酶的活性,从而直接或间接影响细胞的各种生物学行为。有研究证实：TRPC6是HGF诱导的钙内流的调停者,TRPC6介导HGF诱导肾小管细胞增殖；HGF和表皮生长因子诱导TRPC6的过表达从而促进肝癌细胞的增殖等。因此,研究和开发高选择性和高特异TRP通道药物,可为肿瘤的治疗提供新的思路。RNA干扰技术(RNA interference)能有效沉默特异基因的表达,本实验应用RNAi沉默TRPC6基因,研究TRPC6阳离子通道在HGF诱导的PC增殖中的作用。根据以上研究背景,为了明确HGF对PC生长的作用机制并探寻治疗PC的途径,本课题从以下方面进行研究：①将构建的pBudCE4.1-EGFP/NK4真核表达载体稳定转染前列腺癌DU145细胞中,观察其对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及如何调节HGF受体c-Met及其下游的ERK1和Akt1／2信号通路,进一步明确HGF拮抗剂NK4基因的抗肿瘤作用机制。②检测TRPC6在BPH、PC及前列腺癌细胞系中的表达,探讨TRPC6的表达与PC进展的关系。利用siRNA技术对前列腺癌DU145细胞进行TRPC6干扰,检测胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)、细胞增殖和细胞周期等指标,进一步探讨TRPC6对PC增殖作用的影响及与HGF的相关性,为防治PC提供新思路和新靶点。材料与方法一、实验材料1、细胞株前列腺癌细胞株Du145、PC3和22Rvl购于中国医学科学院基础医学研究所。2、组织标本收集中国医科大学盛京医院2004年至2008年手术或穿刺活检的PC和BPH组织标本,142个PC患者得到153张切片(131个患者各一张切片,11个患者各2张切片),20个BPH患者各一张切片。二、主要研究方法1、建立稳定表达NK4蛋白的细胞系pBudCE4.1-EGFP/NK4质粒的转化、扩增、提纯,酶切鉴定。Zeocin筛选转染最佳浓度,Lipofectamine 2000转染DU145细胞株,Zeocin筛选稳定表达NK4细胞株,应用Western blot进行分泌NK4蛋白的检测。2、MTT法测定细胞增殖能力噻唑蓝[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]染色法检测转染NK4基因以及TRPC6干扰后DU145细胞增殖的变化。3、Transwell法测定细胞迁移能力细胞密度为1×105／ml的细胞悬液0.2ml加入上室,下室加入含有10ng／ml HGF的10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)培养基0.5 ml,37℃,5%CO2培养箱孵育6h,擦净小室上面的细胞,用甲醇／冰醋酸固定30min,Giemsa染色,光镜下计数细胞。4、Matrigel小室测定细胞侵袭能力Transwell小室涂布Matrigel基质胶,细胞密度为1×105／ml的细胞悬液0.2ml加入上室,下室加入含有10ng/ml HGF的10%FBS培养基0.5 ml,37℃,5%CO2培养箱孵育24h,擦净小室上面的细胞,用甲醇／冰醋酸固定30min, Giemsa染色,光镜下计数细胞。5、免疫组化检测TRPC6在PC、BPH组织中的表达采用链霉素抗生物素蛋白氧化物酶免疫组化法(streptavidin-peroxidase conjugated method, SP法),标本石蜡切片,TRPC6一抗体孵育,4℃过夜,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)缓冲液代替一抗为阴性对照。以棕黄色颗粒着色,膜着色清楚、连续且明显高于背景为阳性。结果判定：每张切片随机选取5个视野,按阳性细胞所占细胞数量百分比分为5级：阳性细胞数1%-10%为0,1%～5%为1级,5%～10%为2级,10%～0%为3级,20%～50%为4级,>50%为5级。6、RT-PCR检测TRPC6 mRNA的表达收集Du145、22Rvl、PC3细胞,采用Trizol试剂提取总RNA,检测纯度及含量,反转录成cDNA,以TRPC6基因引物进行PCR扩增,以β-actin为内参照,条带进行灰度值分析。7、Western blot检测NK4、c-Met、p-c-Met、Akt1/2、p-Akt1/2、ERK1、p-ERK1、β-actin、TRPC6蛋白的表达收集细胞提取总蛋白,BCA法检测蛋白质含量。进行SDS-PAGE电泳,转印至PVDF膜。封闭,NK4、c-Met、p-c-Met、Akt1/2、p-Akt1/2、ERK1、p-ERK1、TRPC6、β-actin一抗孵育过夜,相应的二抗孵育,增强型化学发光(enhance chemiluminescence, ECL),拍照,以β-actin为内参照,条带进行灰度值分析。8、TRPC6 siRNA及干扰效率检测TRPC6 siRNA的设计,合成3对siRNA,使用荧光标记质粒FAM-siRNA检测转染效率,根据筛选出的最佳条件进行RNA干扰,Western blot筛选干扰效率。9、钙成像细胞数约为1×105／ml播种在共聚焦皿,5μM Fura 2-AM37℃孵育,再用HEPESbuffer saline孵育1h,在检测过程中用OAG刺激,用荧光倒置显微镜检测并记录[Ca2+]i变化。10、流式细胞仪检测细胞周期制成1×107／ml细胞悬液,95%乙醇固定30min,PBS冲洗后用RNase处理15min,用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液作用细胞30min,流式细胞仪检测细胞周期分布。11、统计学分析采用SPSS11.5统计软件包对数据进行统计分析,数据结果以x±s表示,以P<0.05为判断差异显著性标准。结果1、对质粒酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳可见约1326bp的片段,表明NK4片段插入pBudCE4.1-EGFP载体上,最终得到pBudCE4.1-EGFP/NK4双基因表达载体。Western blot检测发现,稳定转染NK4基因的DU145细胞能够自分泌分子量约50KD的NK4蛋白。2、MTT检测显示,HGF对前列腺癌细胞具有增殖作用,单纯的NK4基因转染对细胞增殖没有影响,而在HGF存在的情况下,自分泌的NK4可以抑制HGF对DU145细胞的增殖作用。Transwell小室检测发现自分泌NK4减弱HGF诱导的DU145细胞的运动。Matrigel侵袭小室检测发现转染NK4基因抑制HGF诱导的DU145细胞的侵袭。3、Western blot检测发现,c-Met在前列腺癌DU145细胞中表达,HGF诱导磷酸化的p-c-Met、p-ERK1和p-Akt1／2增多,而自分泌NK4可以有效抑制HGF诱导的c-Met、ERK1和Akt1／2蛋白的磷酸化。4、免疫组织化学检测发现TRPC6在BPH中弱表达,在PC中的表达明显高于BPH。TRPC6的表达与PC的组织分级、Gleason评分及前列腺外转移有关。RT-PCR检测Du145、PC3和22Rvl前列腺癌细胞中有TRPC6 mRNA的表达。5、转染TRPC6 siRNA质粒后TPRC6表达减少,siRNA1和siRNA2两组在干扰后72h干扰率达到60%～70%。OAG诱导[Ca2+]i增加,而在细胞外Ca2+缺乏的情况下OAG诱导不能引起[Ca2+]i增加；siRNA TRPC6使[Ca2+]i降低,同时OAG诱导Ca2+内流明显下降。另一方面,HGF刺激使DU145细胞TRPC6蛋白表达增多,HGF使OAG诱导[Ca2+]i增加；siRNA TRPC6使细胞阻滞在G2／M期。结论1、转染NK4基因的DU145细胞可以自分泌NK4蛋白。NK4可以抑制HGF诱导的c-Met及其下游的ERK和Akt1／2蛋白的活化,从而调节肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。NK4作用于HGF/c-Met可以作为治疗PC的一个有效靶点。2、TRPC6在BPH中弱表达,在PC中的表达明显高于BPH。TRPC6的表达与PC的组织分级、Gleason评分及前列腺外转移有关。TRPC6在22Rvl、PC3和DU145细胞系中均表达。3、TRPC6通道能够调节DU145细胞的Ca2+内流。阻断TRPC6通道可以抑制DU145细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G2／M期。HGF可以增加TRPC6蛋白的表达水平,使OAG诱导的Ca2+内流增加。因此,TRPC6通道介导的Ca2+内流在HGF诱导的细胞增殖中起重要作用。