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在儿童和少年中，90％以上的上呼吸道感染是由病毒引起的。引起感冒的病毒种类很多，至少涉及7个病毒科的10多类共200多个型别的病毒。Heikkinen T，Jarvinen A(2003)认为引起呼吸道感染的病毒还有约1／4尚未被发现。近年来，呼吸道病毒频繁爆发或局部流行，旧的病毒不断变异，新的病毒不断产生。2001年，荷兰学者首次发现一种新的呼吸道病毒—人偏肺病毒；2003年SRAS爆发；继SARS爆发后，又有两种新的冠状病毒分别被发现：荷兰学者报道的人冠状病毒NL63(Coronavirus NL63)及香港首次发现的人冠状病毒HKU1(Coronavirus HKU1)；2005年瑞典学者报道一种新的细小病毒—人博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)，同样与儿童呼吸道感染有关，已受到广泛关注。目前世界各国对HBoV的研究主要集中于检测方法的建立和HBoV感染的流行病学调查。本课题主要研究我国人博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)的分子流行病学，在实验室初步建立HBoV的分子生物学检测方法和血清学诊断方法。主要目标是希望从分子水平来阐明我国HBoV病毒的流行、分布、变异及与疾病的相关性，并通过抗原蛋白的表达纯化，为建立血清学诊断方法研究奠定基础，并可为进一步研究病毒蛋白的功能和病毒相关疾病的治疗提供参考，为HBoV可能的病原检测监测提供科学依据。一、HBoV分子流行病学1、HBoV的分子检测1)从因呼吸道感染而住院的儿童的鼻咽抽吸物样本中提取总核酸，逆转录后，PCR扩增目标病毒基因保守区，如凝胶电泳显示该片段并测序证实，则可确定为目标病毒阳性。2)从因呼吸道感染而住院的儿童的鼻咽抽吸物样本中提取总核酸，逆转录。选择人博卡病毒的NS1基因作为目标基因，设计荧光定量PCR引物和检测探针，以重组质粒为标准品建立标准曲线，从而建立特异性检测人博卡病毒的荧光定量PCR方法。2、HBoV流行病学调查调查包括HBoV在特定人群中的发生、发展和疾病及健康有关状态与分布规律。结果显示HBoV主要与支气管炎，肺炎和支气管肺炎相关联，在所检测的人群中的发生率约为8.3％，患者主要为2岁以下的婴幼儿。3、HBoV基因的克隆及衣壳变异分析利用克隆的HBoV基因和Genbank中的数据分析HBoV的变异规律。二、VP1-U蛋白表达纯化分析HBoV衣壳蛋白(VP1)序列抗原性，选择抗原性较高的VP1独有区(VP1-U)表达。将VP1-U的核酸序列进行密码子亲嗜改造，插入到pET30a(+)中(3’末端带His标签)，转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达，超声裂解细菌，镍柱亲和层析获得纯品。