胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。全球每年约有100万新增胃癌患者，同时有80万患者死亡。中国胃癌发病率占全世界的42%，死亡率占35%，是世界平均水平两倍多。我国早期胃癌的检出率平均为10%，90%中晚期胃癌的5年生存率不足20%；手术是目前唯一根治胃癌的方法，但只有不足1/3的人能够进行手术治疗，而且这1/3的病人也不是纯粹的早期胃癌，对于中晚期病人除进行手术治疗外常配合化疗、放疗等治疗手段；但化疗和放疗副作用太大，往往严重破坏患者的免疫系统。很多肿瘤的抗药性越来越严重，加大了治疗的困难。目前进行的疫苗等生物治疗尝试，尚未获得理想结果。本实验以反向17肽胃泌素为导向单元设计抗胃癌靶向药物，在此基础上优化表达条件、进行重组毒素的纯化，并进行细胞杀伤实验确证该重组毒素的癌细胞靶谱，以期为临床实验病例筛选和个性化治疗方案设计提供指导。胃癌发生时，肿瘤细胞膜上胆囊收缩素受体（CCK-2R）表达量与亲和力都明显增加，而正常组织不表达或表达量极低，形成几十至上千倍的差异，表明CCK-2R高表达与胃癌发生及恶化程度有关。本实验利用基因工程手段分别将正向与反向的17肽胃泌素与截短并修饰的绿脓杆菌外毒素（PE38KDEL）进行重组，制备胃癌靶向免疫毒素。大肠杆菌表达所得以反向胃泌素片段为导向单元的重组毒素rG17PE38对BGC-823、MGC-803与SGC-7901胃癌细胞系具有很好的杀伤作用，western blot证明其可被抗人胃泌素抗体及抗PE38抗体识别。密码子偏爱性是原核表达中最重要的一个影响因素，为便于蛋白纯化及下游实验，本文先后对靶基因进行了两次优化，最终获得一株高表达重组菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)，表达量可达全菌体蛋白的40%以上，28.7℃诱导时绝大多数目的蛋白以可溶形式表达；然而高表达只能在试管摇培条件下获得，三角瓶诱导不表达，遇到表达体系无法放大的问题。经培养基筛选及组分优化后，获得适合三角瓶生产的发酵条件：1%接种量接种SOB培养基，OD值约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG，28.7℃继续培养4h。由于该蛋白自身的特性，常规方法纯化得率太低；本文以切胶回收方式制备免疫原，足垫免疫Balb/C鼠，以LHRH-PE38为检测原筛选杂交瘤细胞株；获得3株稳定分泌PE38单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3B9株分泌抗体呈现良好的醇洗脱反应性；温和条件下即可与PE38识别与解聚，最佳洗脱条件为50mM Tris-HCl, pH7.9,850mM NaCl,40%propyleneglycol,1mM EDTA。将辛酸-硫酸铵法纯化的3B9抗体与CNBr活化的Sepharose4FF介质偶联，制备PE38的亲和层析柱；同时优化组合硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析等纯化条件，最终获得纯度达92%以上的rG17PE38蛋白。对包括BGC-823、MGC-803、SGC-7901胃癌细胞，LOVO、HCT-8、SW480、SW620、Caco-2、SW116结肠癌细胞及PANC-1胰腺癌细胞在内的30余株细胞进行靶向杀伤实验；并利用CCK-8试剂盒，测定该免疫毒素对各细胞的IC50值。结果表明，rG17PE38对胃癌细胞具有靶向特异的杀伤活性，对部分结肠癌细胞有细胞毒作用，对其它癌细胞及正常细胞没有明显毒性。本文制备的rG17PE38重组毒素分子量小、靶向性好，其rG17单元可执行酰胺化胃泌素的靶向功能；细胞毒试验证实对胃癌细胞杀伤活力强，对正常细胞毒性小，具有良好的应用前景和坚实的科学基础，有可能成为胃癌非手术性治疗方法，为转移性或扩散性胃癌的生物性治疗开辟新途径。