【摘 要】
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目的 本研究通过构建miR-6732-3p表达水平差异的鼻咽癌细胞,采用细胞和动物实验相结合的方式,探究miR-6732-3p表达量改变对鼻咽癌的生物学行为及其放射敏感性的影响。并明确miR-6732-3p是否能通过调控放射线诱导的鼻咽癌细胞自噬作用影响鼻咽癌的放射敏感性,进一步探索影响鼻咽癌放射敏感性的关键靶点及明确其发生、发展机制,为鼻咽癌病人制定个体化治疗方案提供一个重要研究方向。方法 首先
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目的 本研究通过构建miR-6732-3p表达水平差异的鼻咽癌细胞,采用细胞和动物实验相结合的方式,探究miR-6732-3p表达量改变对鼻咽癌的生物学行为及其放射敏感性的影响。并明确miR-6732-3p是否能通过调控放射线诱导的鼻咽癌细胞自噬作用影响鼻咽癌的放射敏感性,进一步探索影响鼻咽癌放射敏感性的关键靶点及明确其发生、发展机制,为鼻咽癌病人制定个体化治疗方案提供一个重要研究方向。方法 首先,运用实时荧光定量逆转录-聚合酶反应(RT-q PCR)技术检测miR-6732-3p在鼻咽癌细胞株CNE-2、鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R及人永生化鼻咽上皮细胞株NP69中的表达情况。然后,采用慢病毒介导的RNA转染技术,构建不同miR-6732-3p表达水平的鼻咽癌细胞。并采用CCK8、流式细胞术、平板克隆等一系列细胞功能实验分别评估体外细胞增殖、凋亡、周期及放射敏感性。并利用裸鼠成瘤实验在动物水平验证其肿瘤的放射敏感性。构建鼻咽癌移植瘤裸鼠模型,观察过表达miR-6732-3p对移植瘤放射敏感性的影响。通过生物信息学技术分析miR-6732-3p的靶标,运用蛋白质免疫印迹实验(western blot,WB)验证NRBF2为miR-6732-3p的靶基因。最后,通过WB和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)实验检测细胞和组织内自噬相关蛋白的表达情况。结果 RT-qPCR结果显示在鼻咽癌抗拒株CNE-2R中miR-6732-3p表达量最高,鼻咽癌细胞株CNE-2次之,然而在正常鼻咽部上皮细胞系NP69中miR-6732-3p表达最低(1.000±0.000 vs 4.067±1.078 vs 558.917±78.775,P<0.05)。当miR-6732-3p在CNE-2R细胞中的表达下调时,细胞功能实验结果显示:miR-6732-3p的低表达可使CNE-2R细胞的增殖能力明显受到抑制,照射后其细胞凋亡率较对照组增加了2倍多,细胞处于对辐射敏感的G2/M期的数量也明显增多,细胞克隆形成能力显著下降。沉默miR-6732-3p提高了CNE-2R细胞的放射敏感性。当miR-6732-3p在CNE-2细胞中的表达上调时,细胞功能实验可观察到:在经历辐射后,miR-6732-3p的高表达可使CNE-2细胞的增殖明显加快,克隆形成能力也显著提升。同时,其细胞凋亡不仅受到抑制,而且对放射线不敏感的G0/G1期细胞比例也明显增加,从而降低了CNE-2细胞对放射线的敏感性,增加了放射抗性。动物实验结果进一步验证了miR-6732-3p与鼻咽癌放射敏感性的关系。研究显示当各组裸鼠移植瘤经放射线干预处理后,与对照组相比,过表达miR-6732-3p使裸鼠移植瘤生长速度仅受轻微抑制。这一结果同样证实了上调miR-6732-3p可使裸鼠体内鼻咽癌移植瘤的放射抗性增加。通过生物信息学研究分析发现在Tar Base数据库、miRTar Base数据库、miRDB数据库及Target Scan数据中有13个miR-6732-3p的交集靶基因,分别为SON、HNRNPA0、RAP2A、NRBF2、HNRNPU、PAFAH1B1、RNF2、TMEM9B、ID4、SDC1、CADM1、KSR2、PRICKLE1。我们发现13个交集靶基因在Target Scan数据库中Context++score的绝对值最高的是NRBF2基因,则表明了该靶基因置信度最高。因此,猜测NRBF2基因可能是miR-6732-3p的有效靶标。Western blot结果显示miR-6732-3p过表达的鼻咽癌CNE-2细胞中NRBF2明显被抑制,该结果有效证明了NRBF2是miR-6732-3p的靶基因。随后,利用Western blot技术对鼻咽癌细胞和移植瘤组织中自噬蛋白进行检测分析,结果均显示了过表达miR-6732-3p可使CNE-2细胞和移植瘤中LC3B的表达明显上调,而蛋白P62被下调。其结果表明了在辐射条件下,过表达miR-6732-3p可增强鼻咽癌CNE-2细胞的自噬反应,降低其细胞放射敏感性。同样地,免疫组化结果也支持这一观点。结论 miR-6732-3p在调控鼻咽癌放射敏感性方面发挥着一定的作用。体内和体外实验均显示了过表达miR-6732-3p可增加鼻咽癌CNE-2细胞对射线的抗拒性。我们推测miR-6732-3p可能通过靶向NRBF2调控射线诱导的鼻咽癌CNE-2细胞自噬反应从而影响其放射敏感性。
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