研究背景严重烧伤所造成的急性创面对于人民生命健康的威胁一直是我们非常关注的问题。与此同时,随着社会进步和生产力提高,导致人民生活水平提高、寿命延长,相应出现的慢性创面如糖尿病足、压疮等患者明显增加。无论是急性创面患者还是慢性创面患者,伤口局部或多或少地都会存在坏死组织及其分解物。而在大面积深度烧伤、严重电击伤、肢体挤压伤或严重糖尿病足患者中,机体会产生更加大量的坏死物质。过去人们对创面的认识是一个逐步加深的过程。由于创面的存在,导致机体体液丢失,引起一系列的病理生理变化,所出现的休克等难题得到高度重视。不断的体液渗出并在局部聚集,造成身体营养的不良、免疫力的下降、微生物良好的生长环境,因此有关营养、感染问题也倍受关注。但创面渗出物、坏死物本身对机体的影响却少有提及。组织坏死物除了作为良好的细菌培养基外,本身是否会对机体产生影响?产生怎样的影响?何种成分在起主要作用?这些问题目前尚缺乏明确答案。拟似局部组织坏死组织引起全身性损害的现象在临床上常常可以见到：大面积深度烧伤后,机体会出现SIRS、DIC、甚至MODS。严重灾祸(如地震、车祸等)可造成挤压综合症,当患者获救减压后,有些伤员在医疗后送的途中就发生死亡。过去有人指出系大块肌肉坏死致血钾升高所致。但有人曾留意到大块的肌肉坏死并不一定血钾升高,可死亡照样发生。气性坏疽病例中,它除了伤口恶臭外,贫血、低蛋白血症也是常有的伴随症状,如处理不及时,死亡难以避免。慢性创面伴有组织湿性坏死时,可以出现恶病质样改变(消瘦、贫血、低蛋白血症、甚至腹水等),在严重糖尿病足患者中,此现象更为常见,更为明显。如上所述的现象里,似乎有这样一条线索摆在我们面前：大量的、充满异味的坏死组织一吸收入血后-机体损害一严重时危及生命。何种坏死物会对机体产生损害?既往的研究表明,烧伤后机体可产生“烧伤毒素”,但究其成分,众说不一：有说是“脂蛋白复合物(LPC)”、或是变性蛋白,有说是“脂质过氧化物(LPO)”,甚至还称是“中分子物质”、内毒素。但无论如何,大量的实验证明上述物质都不足以导致迅速的、或难以逆转的生命损害。真正的损害因素尚不得而知。大家知道,坏死组织在蛋白酶的作用下可水解成氨基酸,再经氨基酸脱羧基作用,产生腐胺、尸胺、吲哚等,其中具有明显生物毒性的物质以多胺为主,腐胺与尸胺更是拥有剧烈毒性。目前已知腐胺、尸胺既作为一种腐毒碱存在于腐败物中(含量以腐胺居多),也作为生物体的正常成分而广泛存在于细胞中,微量情况下,对机体的细胞增生、分化、修复起着促进作用,但当机体局部组织严重坏死后,伴随腐胺和尸胺的大量吸收,并在血中超过某种浓度时,会在体内扮演着怎样的角色?是否会引发体内的炎症介质的升高,导致全身性炎症反应综合症的发生,造成机体全身性的损害?为探讨上述问题,我们分别建立了外源性腐胺、尸胺经家兔腹腔吸收模型,并以坏死组织匀浆液、生理盐水为对照,动态检测不同物质诱导机体炎症因子的浓度变化,分析其对机体炎症因子影响的异同。结果发现,灭菌处理后的创面坏死组织匀浆液可引起全身性炎症反应,对机体炎症因子的诱导时间早于内毒素,并且炎症因子的高峰值甚于内毒素,这强烈提示创面坏死组织分解物中可能隐藏着某种比单纯内毒素更强的刺激因子。虽然外源性腐胺和尸胺都可引起机体炎症反应,且尸胺导致的炎症反应更强烈。但是腐胺诱导机体炎症反应与坏死组织匀浆液所诱导的趋势较为接近,提示腐胺在坏死组织分解物诱导炎症反应中可能起着更重要的作用。因此锁定其中的“主要损害物”为腐胺。我们试图通过对大鼠给予外源性腐胺进行干预,观察肝、肾等重要脏器生理功能和组织形态改变、细胞凋亡情况,了解其对机体的影响和病理生理改变过程,理清局部坏死与全身损害的关系,为临床开展积极有效的预防和治疗提供理论依据。研究目的：1、分别观察健康SD大鼠在不同浓度的外源性腐胺的干预下,对肝、肾等重要脏器组织、细胞结构和功能的影响；2、观察健康SD大鼠在不同浓度的外源性腐胺的诱导下,肝、肾细胞异常凋亡程度和变化规律；3、初步了解外源性腐胺作用于机体的毒性表现和可能的致害浓度阈值范围,进一步揭示局部坏死与全身损害的关系。材料和方法：1.实验动物及分组清洁级健康SD大鼠90只,体质量(200±20)g,雌雄不限,由广东省医学实验动物中心提供。SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为两组：正常对照组(N组,n=10),外源性腐胺注射组(P组,n=80)。其中P组设50μg.g-1和25μg.g-1两种腐胺浓度亚组(P1组,n=40；P2组,n=40),各亚组设腹腔内注射(IP)后24h、48h、72h、96h共4个时相点作为机体肝、肾脏器的观察时相点。各业组各时相点均为10只。2.实验方法外源性腐胺注射组(P组)大鼠从实验开始(0h)时分别使用50#g’g-1和25/μg-g-1两种浓度的腐胺混合生理盐水稀释液共2m1行大鼠腹腔内注射1次。然后于实验开始后各时相点每一浓度活杀10只,活杀后即开腹心脏采血,同时摘取肝、肾器官并固定组织标本。而正常对照组(N组)只于大鼠腹腔内注射等量的生理盐水,注射后24h全部活杀。所有实验动物分笼喂养,饲料进食,活杀前6h禁水、食。3.检测指标及方法3.1观察实验大鼠一般情况。实验期间,连续观察并记录注射后各时间点大鼠的一般情况,包括大鼠活动度、精神状况、进食、尿量、大小便颜色及气味,眼白及皮毛染色(有无黄疸),死亡率等。3.2受检脏器病理变化。摘取肝、肾器官常规制作病理切片,HE染色后光镜下观察肝、肾器官组织形态学改变；3.3生化指标检测。各组各时相点活杀后分别心脏采血2-3.5m1,置于普通干燥试管内静置30分钟,2500r/min离心15分钟分离血清,-76℃保存。采用全自动生化分析仪测定血清中Cr、BUN、ALT、AST的含量；3.4DNA原位末端缺口标记技术(TUNEL法)检测细胞凋亡。大鼠肝、肾组织予4%多聚甲醛固定后常规制作组织切片,按TUNEL试剂盒说明书要求操作,高倍镜下观察凋亡阳性细胞,再通过专业图像分析软件计算肝、肾细胞凋亡率4.统计学处理各组数据中,计量资料用均数±标准差(x-±s)表示,计数资料以百分比(%)表示。应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。本实验为2×4*4的析因设计,计量资料行完全随机分组两因素析因分析(即two-way analysis of variance),了解各变量之间的主效应和交互作用；各时间组、浓度组之间采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),然后用Levene’s test检验方差是否齐性(检验水准a=0.05),如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的LSD检验,反之,如果方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行方差分析后,Dunnett’s T3检验进行两两比较,假设检验为双侧检验,检验水准α=0.05,P<0.05时差异具有统计学意义。由于计数资料2×3格表中出现0,将0调整为0.5后行Pearson Chi-Square检验方法,当p<0.05时,差异具有统计学意义。结果(1)P组大鼠注射后出现短暂急性毒性症状,其中P1组多数呈精神抑制改变,P2组多数呈兴奋型改变,P1组和P2组比较,精神状态改变存在显著差异(X2=69.408,p<0.01);(2)P组大鼠各亚组各时相点肝、肾病理切片HE染色后在光镜下见肝、肾组织少部分有轻度的水肿,无明显的细胞坏死；(3)血清生化指标提示,与N组比较,Cr、BUN、ALT、AST含量于外源性腐胺注射后24h、48h、72h、96h基本呈不同程度升高。P1和P2两亚组间不同腐胺浓度进行比较,Cr、BUN、AST值均存在显著差异(F-4.759,P=0.032；F=10.88,P=0.002；F=12.21,P=0.001),其中：Cr、BUN值P2组>P1组,AST值P1组>P2组；P1和P2两亚组间不同时相点进行比较,Cr、BUN、ALT、AST值也均存在显著差异(F=14.322,P=0.000；F=15.84,P=0.000；F=3.23,P=0.027；F=8.22,P=0.000);Cr、BUN、ALT、AST四项指标中P1和P2两亚组间腐胺浓度和时相点交互效应显著(F=5.314,P=0.003；F=9.441,P=0.000；F=16.582,P=0.000；F=I1.811,P=0.000)。与N组比较,实验组各检测指标值基本于24h后开始升高,72h后升高明显,其中Cr、BUN、ALT值于96h后达到峰值(P<0.05)(4)采用TUNEL法检测发现,P1组肝、肾组织中凋亡细胞逐渐增多,96h后达峰值。P1组96h时相点与N组比较,肝细胞凋亡率明显升高[(15.29±1.41)%vs(3.50±0.30)%,P<0.01],肾细胞凋亡率也明显升高[(24.78±2.19)%vs(4.47±0.33)%,p<0.01]；P2组中肝、肾组织中凋亡细胞于注射后48h即达到峰值,96h后逐渐回落至正常。P2组48h时相点与N组比较,肝细胞凋亡率明显升高[(13.81±1.66)%vs(3.50±0.30)%,P<0.01]、肾细胞凋亡率也明显升高[(26.27±2.13)%vs(4.47±0.33)%,P<0.01]。结论1一定浓度的外源性腐胺能导致肝、肾等重要脏器功能出现不同程度的损害,但在光镜下不一定伴有肝、’肾组织形态学上的明显异常；2.外源性腐胺可诱导肝、肾细胞高凋亡率,凋亡程度与外源性腐胺存在时间-剂量效应；3.本实验中两种腐胺浓度所致细胞凋亡率走向趋势正好相反,表明能诱导肝肾细胞凋亡的最佳腹腔攻击浓度在(25μg·g-1·50μg·g-1)之间,但血清腐胺最佳效应浓度尚不能肯定；4.外源性腐胺所致的肝、肾功能改变可能与其诱导细胞高凋亡率有关；5.本实验浓度下的外源性腐胺干预健康SD大鼠具有一过性的急性非致死毒性表现,表现形式与浓度有关。其临床意义尚不明了。