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第一部分PTCHD1在难治性癫痫患者（Temporal lobe epilepsy,TLE）及两种动物模型中的表达实验目的:用免疫印迹的方法检测PTCHD1在两种（海人酸及戊四氮）慢性癫痫小鼠模型脑组织中的表达及难治性癫痫患者和对照组表达情况。方法:1.从本课題组之前脑标本库中（约380例难治性颞叶癫痫患者术后脑组织和约100例非癫痫脑外伤患者脑组织）随机选取15例难治性颞叶癫痫脑组织作为实验组,选取10例的脑外伤非癫痫脑组织作为对照组标本。2.选取成年雄性C57BL小鼠（体重20-30g,10-14周龄）,构建癫痫动物模型之一:戊四氮（PTZ）慢性点燃小鼠模型,癫痫发作4级以上为点燃成功组（例数为8）和无癫痫发作即未点燃成功组（例数为8）作为动物模型标本。3.另一种动物模型为海人酸腹腔注射诱导慢性癫痫模型,选取有自发性反复发作为癫痫组（SRS,n=8）和无自发性反复发作为无癫痫发作组（non-SRS,n=8）。4.用免疫荧光检测PTCHD1表达部位后用免疫印迹方法检测PTCHD1表达情况。实验结果:1.免疫印迹方法检测表达后发现难治性颞叶癫痫患者（Temporal lobe epilepsy,TLE）术后脑组织及对照组脑外伤非癫痫脑组织中均有PTCHD1表达,并且统计其表达量在癫痫患者术后脑组织中PTCHD1的表达较对照组脑外伤非癫痫脑组织中的表达量显著降低（★p<0.05）。2.在两种动物模型中PTCHD1在戊四氮慢性点燃成功小鼠组中海马和皮质中的表达较未点燃成功组中的表达明显减低。在另一种动物模型即海人酸诱导的慢性癫痫小鼠模型中PTCHD1在有癫痫发作组（有自发性发作）小鼠海马和皮质中表达水平均较对应的无癫痫发作组明显减低（★p<0.05）。3.免疫荧光结果提示难治性颞叶癫痫患者脑组织中PTCHD1与神经元标记物MAP2共表达。两种慢性癫痫动物模型中的免疫荧光也得出同样的结果。结论我们实验结果提示PTCHD1在TLE患者和两种慢性癫痫小鼠模型脑组织中表达较相应的对照组比较明显降低,免疫荧光检测提示PTCHD1与神经元共表达。以上结果提示PTCHD1可能参与了癫痫的发生发展。第二部分PTCHD1对海人酸动物模型及戊四氮癫痫动物模型行为学的影响及可能机制实验目的:为进一步探讨PTCHD1与癫痫的关系是因果关系还是伴随关系,我们构建了以GV358为载体的PTCHD1过表达病毒（LV-PTCHD1）和以GV248为载体的PTCHD1 sh RNA干扰病毒（LV-sh-PTCHD1）。通过小鼠海马立体定位注射改变小鼠海马内PTCHD1表达水平,观察PTCHD1对海人酸慢性癫痫模型和戊四氮慢性点燃模型行为学的影响及可能机制。实验方法:1.分别构建PTCHD1过表达病毒（LV-PTCHD1）、PTCHD1过表达空病毒（LV-CON）、PTCHD1 sh RNA干扰病毒（LV-sh-PTCHD1）和PTCHD1 RNA干扰空病毒（LV-sh-CON）。2.实验动物选成年雄性C57BL/6小鼠,并用随机方法分为五组,用立体定位在双侧侧脑室内分别注射PTCHD1过表达病毒、PTCHD1过表达空病毒、PTCHD1 sh RNA干扰病毒、PTCHD1 sh RNA干扰空病毒,余下的一组为对照组:不注射任何病毒也叫假手术组。3.打完病毒2周后应用Western-blot技术检测病毒转染效率,观察是否特异性影响PTCHD1的表达水平。4.海人酸慢性癫痫模型行为学观察的结果:在过表达PTCHD1和抑制PTCHD1的癫痫模型中,造模后从第一次发作开始持续视频监测小鼠癫痫自发性发作情况。分别统计潜伏期和总的发作次数,严重程度以Racine评分评估。视频监测完行为学后记录场电位,观察和统计每次癫痫样放电持续的时间和癫痫样放电的次数。5.戊四氮慢性点燃模型（另外一种机制的模型）行为学观察:在抑制PTCHD1和过表达PTCHD1的癫痫模型中,阈下剂量腹腔注射戊四氮,间隔时间为每隔一天注射一次,每次注射后观察发作级别及潜伏期并做统计。6.通过免疫荧光方法检测PTCHD1在突触前后的定位来说明其可能作用的部位。实验结果:1.海马立体定位分别给LV-PTCHD1、LV-CON、LV-sh-con、LV-sh-PTCHD1组注射后Western-blot结果显示:与对照组比较LVsh-PTCHD1组的表达量显著降低（★★p<0.01）。而过表达组LVPTCHD1表达与相应时间点对照组相比表达显著增高（★★p<0.01）。2.戊四氮慢性点燃模型整个过程中LV-PTCHD1组每次打完PTZ后平均发作分级较对照组在相应的时间点上显著降低,LV-sh-PTCHD1组各时间点平均发作分级较对照组显著升高（★★p<0.01）。3.海人酸动物模型行为学统计结果为:与对照组相比慢性自发性发作期内（2-6w）,LV-PTCHD1组潜伏期延长并自发性发作次数减少。LV-sh-PTCHD1组潜伏期缩短并自发性发作次数增多（★p<0.05,★★p<0.01）而局部场电位中癫痫样放电的次数增加。4.免疫荧光结果显示PTCHD1只与抑制性突触后标志物Gephyrin共定位与抑制性突触前标记物v GAT无共定位。实验结论:1.海马立体定位注射慢病毒PTCHD1过表达、PTCHD1-sh RNA抑制病毒可以使海马PTCHD1的表达水平有变化,注射后2周病毒转染成效。2.在戊四氮动物模型中慢病毒介导的PTCHD1抑制能加重各时间点平均发作分级,在点燃过程中,PTCHD1过表达组各时间点的发作级别明显减低。3.海人酸诱导的动物模型中慢病毒介导的海马PTCHD1过表达能减少慢性期自发性发作的次数、癫痫样放电的频率、癫痫样放电的持续时间和延长潜伏期,而抑制PTCHD1则导致相反的结果。4.免疫荧光结果显示PTCHD1只与抑制性突触后标志物共定位。故PTCHD1可能作用于抑制性突触后受体来影响癫痫的发病发展。