本研究分包含四个实验设计：实验1、在DMEM基础培养基中,添加孕马血清促性腺激素(PMSG：eCG)体外成熟培养48小时,对犬卵母细胞体外核成熟的影响。实验2、在TCM199中添加0.6%葡萄糖,以胰岛素(Insulin)调节,探索犬卵母细胞体外成熟培养液中是否必须添加血清；添加最优浓度胰岛素延长培养时间对犬卵母细胞体外成熟的影响。实验3、以TCM199+10%FBS+1mg/mL半胱氨酸+0.2mM丙酮酸盐为基础培养基,研究雌激素,孕激素对从不同繁殖期(发情前期；发情期；黄体期和乏情期)犬卵巢收集卵母细胞核成熟的影响。实验4、评价L-半胱氨酸对犬卵母细胞体外成熟及不同成熟培养时间卵母细胞内GSH水平的影响,为探索犬卵母细胞体外成熟培养体系提供参考。采用随机切割法收集卵巢表面卵丘卵母细胞复合体(COCs)；根据实验设计不同培养基或不同培养时间,38.5℃,5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养后,在D-PBS加0.1%透明质酸酶中,用细小玻璃管剥离卵丘细胞从而获得裸卵,为了鉴别核成熟期,用4%甲醛溶液固定裸卵15分钟,然后用10μg/mL Hoechst33342染色、压片,荧光显微镜下(355nm激发波长)观察核形态。其中实验四采用“双染法”：50μg/mL PI染色统计成活率、10μ¨g/mL Hoechst33342染色统计核成熟期；打碎卵子用GSH试剂盒测定不同培养时间(0、48、72小时)卵子内谷胱甘肽(GSH)的含量。各实验结果如下：实验1、体外培养48小时后,添加PMSG处理组,卵丘扩散明显,然而,发育到MⅠ-MⅡ的比率分别为(10.2±13.0；5.3±7.7；13.2±13.5)没有显著差异(P<0.05)。加100IU/mLPMSG处理组GVBD期率(7.7±7.1)显著低于对照组(24.1±12.1)。PMSG的添加改善了卵丘扩散的效果,但是没有提高核成熟率,需要进一步改进犬卵母细胞体外成熟率的培养体系。实验2、不同浓度胰岛素培养48 h后,各组卵丘细胞扩散效果都不明显；卵母细胞核成熟期没有达到减数分裂中期(MⅡ),但是6IU/mL胰岛素组生发泡破裂期(GVBD)比率(35.88%±14.63%)显著高于对照组(11.25%±9.75%)；6 IU/mL胰岛素组延长培养时间至72和96 h后,MⅠ-MⅡ比率分别为20.8%±10.9%、13.33%±1.5%。根据以上结果表明,犬体外成熟培养基中添加胰岛素既没有提高犬卵母细胞核成熟到MⅡ期,也没有改善犬卵母细胞卵丘扩散效果。但是,在6 IU/mL浓度下延长培养时间,相对增加了成熟率。实验3、成熟培养48小时后,培养基中添加4μg/mL P4组发情期卵母细胞MⅡ期比率(21.43±5.98)显著高于其它组；添加2ug/ml E2黄体期卵母细胞达到MⅡ期比率(17.37±3.80)显著高于其它组。说明在培养基中添加孕激素、雌激素没有增加犬卵母细胞体外成熟率。然而,发情周期在选择体外成熟培养试验中是关键因素。实验4、培养基中添加0.1 mg/mL、1 mg/mLL-半胱氨酸组成活率(63%、72%)高于不添加组成活率(61%)；核成熟方面,达到M1-M11期1mg/mLL-半光氨酸处理组为15.16±4.2高于其它处理组。不同L-半胱氨酸浓度不同培养时间对卵子内谷胱甘肽的合成量无显著差异。