【摘 要】
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目的:研究典型瞬时受体电位6（transient receptor potential canonical 6,TRPC6）/活化T细胞核因子2（Nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2）在高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤中的作用。方法:1.在体动物实验:选用链脲佐菌素（STZ）对SD雄性大鼠腹腔注射进行造模,造模成功之后,采用肾盂注射法将转染病毒试剂经逆
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目的:研究典型瞬时受体电位6（transient receptor potential canonical 6,TRPC6）/活化T细胞核因子2（Nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2）在高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤中的作用。方法:1.在体动物实验:选用链脲佐菌素（STZ）对SD雄性大鼠腹腔注射进行造模,造模成功之后,采用肾盂注射法将转染病毒试剂经逆行注射进入大鼠肾盂,实验分为3组:对照组（Ctrl+腺病毒干扰空载）、糖尿病组（DM+腺病毒干扰空载）和TRPC6治疗组（DM+腺病毒-TRPC6-sh RNA）,病毒注射8周后腹主动脉取血,摘取大鼠肾脏。测量大鼠肾脏质量,计算肾脏体重比;实验结束后取肾组织并采集血液提取血清以待测试,测定血肌酐和尿素氮;通过HE染色和Masson染色,观察肾脏病理变化和组织胶原纤维水平;Western blot检测TRPC6、Collagen IV和Fibronection和NFAT2的蛋白表达量。2.离体细胞实验:大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）于无菌培养室培养给予高糖处理,进行实验,实验分组:对照组（NG 5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇）和高糖组（HG25 mmol/L葡萄糖）,分别处理48 h和72 h,运用Western Blot技术检测HBZY-1中TRPC6、Collagen IV、Fibronection的表达量,qRT-PCR技术检测HBZY-1中TRPC6 mRNA;（2）siRNA-TRPC6和siRNA-NFAT2（50 nmol/l）转染HBZY-1,实验分组:对照组（NG+NC-siRNA）,高糖组（HG+NC-siRNA）和siRNA组（HG+siRNA-NFAT2或TRPC6）,Western Blot检测HBZY-1中TRPC6、Collagen IV、Fibronection和NFAT2的蛋白表达量。结果:1.动物实验:（1）HE染色中各组均未见明显的结构差别和炎症细胞大量出现;Masson染色各组均未见明显的胶原沉积。（2）糖尿病和TRPC6治疗组血糖显著高于对照组（P（27）0.001）;糖尿病组和TRPC6治疗组的大鼠体重显著低于对照组（P（27）0.001）;糖尿病组和TRPC6治疗组的大鼠肾重/体重比值显著高于对照组（P（27）0.001）;糖尿病组和TRPC6治疗组的血清尿素氮显著高于对照组（P（27）0.05）;TRPC6治疗组的血肌酐水平明显低于糖尿病组（P（27）0.05）;（3）Western Blot结果显示糖尿病组的TRPC6、Collagen IV、Fibronection和NFAT2的蛋白表达量明显高于对照组;TRPC6治疗组的TRPC6、Collagen IV、Fibronection和NFAT2的表达则明显低于糖尿病组。2.HBZY-1细胞实验:（1）Western Blot和qRT-PCR结果显示高糖组（25 mmol/L葡萄糖）处理大鼠肾脏系膜细胞48 h和72 h后,TRPC6的蛋白量和mRNA表达明显高于对照组（P（27）0.001）;（2）与对照组比较,高糖组（25mmol/L葡萄糖）的Collagen IV、Fibronection、NFAT2的蛋白表达量明显升高;（3）siRNA-TRPC6转染系膜细胞48 h后,TRPC6的蛋白表达量和mRNA水平明显降低（P（27）0.001）;（4）高糖处理大鼠肾脏系膜细胞48 h后,TRPC6的蛋白表达量和mRNA表达水平高于对照组,siRNA-TRPC6组TRPC6的mRNA和蛋白表达量明显低于高糖组;（5）高糖处理大鼠肾脏系膜细胞48 h,Collagen IV、Fibronection和NFAT2的蛋白表达量明显升高,siRNA-TRPC6后Collagen IV、FN和NFAT2的蛋白表达量明显低于高糖组;（6）siRNA-NFAT2转染后,与高糖组比较,siRNA-NFAT2组的Collagen IV、FN和NFAT2的表达明显低于高糖组。结论:1.糖尿病大鼠肾脏中TRPC6和NFAT2的蛋白表达水平增加;降低TRPC6的表达对糖尿病导致的肾损伤具有一定的保护作用。2.高糖会增加肾小球系膜细胞中TRPC6、NFAT2和ECM合成增加;降低TRPC6和NFAT2的表达可以减少由高糖诱导的ECM合成增加;TRPC6可以通过调节NFAT2的表达介导高糖诱导系膜细胞损伤,调控TRPC6的异常表达可能是糖尿病肾病的治疗药物靶点之一。
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