论文部分内容阅读
心脑血管疾病是近年来威胁人类健康和生命的头号杀手,血栓形成是许多心脑血管疾病的重要诱因,血栓一旦形成,往往形成不可逆的严重后果,抗凝剂是防治血栓形成的重要药物。水蛭素(Hirudin,HV)是欧洲已上市的一个新型抗凝药物,它对凝血酶直接性强抑制,导致凝血参数急剧升高,新蛭素(Neorudin,EH)与水蛭素相比具有良好的特异靶向性,降低水蛭素非特异性导致的全身出血副作用,然而EH是一条小分子短肽,分子量只有7.3 KD,易被肾小球过滤,经尿液排出,使得EH在体内半衰期较短,只有1-2 h,为获得延长重组新蛭素(EH)的半衰期的融合蛋白,本实验制备了通过连接肽连接的重组新蛭素与IgG1 Fc的融合蛋白(EH-L-Fc),并对其进行了功能分析。由于E.coli表达具有易操作、表达周期短等优点,真核表达系统具有对蛋白表达后修饰的优势,本实验分别构建原核、真核表达载体来获得融合蛋白。方法:采用重叠PCR技术构建pelB-eh-L-Fc/Eh-L-Fc融合基因,将pelB-eh-L-Fc克隆至表达载体pET-24a,Eh-L-Fc克隆至表达载体pcDNA3.1中,构建真核和原核表达载体。分别利用转化将pET-24a-pelB-eh-L-Fc转至E.coli BL21,脂质体转染法将pcDNA3.1-Eh-L-Fc转至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。E.coli BL21通过IPTG摇瓶诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达;CHO细胞利用G418抗性筛选稳定克隆株,Western Blot方法检测培养上清中EH-L-Fc蛋白的表达,利用有限稀释法对G418抗性筛选出的混合克隆单克隆化,通过Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,Lowry法检测蛋白浓度,SDS-PAGE、HPLC法检测目的蛋白纯度,质谱法分析分子量,凝血因子Xa裂解融合蛋白后采用纤维蛋白凝块法测定其抗凝活性。结果:成功构建了原核重组表达载体pET-24a-pelB-eh-L-Fc和真核重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc;在E.coli BL21中,经IPTG诱导表达检测到融合蛋白表达;经G148加压筛选获得稳定表达EH-L-Fc的CHO细胞株,protein A纯化获得EH-L-Fc,质谱显示表达产物分子量为72168Da,HPLC检测亲和层析获得的EH-L-Fc纯度达93.9%。完整的EH-L-Fc无抗凝活性,经凝血因子Xa裂解后其抗凝比活性为96.6 ATU/mg。结论:本研究成功构建了原核表达载体和真核表达载体,E.coli BL21中包涵体表达融合蛋白;经过转染筛选成功获得了稳定表达EH-L-Fc的CHO细胞株和较高纯度的重组融合蛋白,且该重组融合蛋白经凝血因子Xa裂解后可释放抗凝活性。因此,EH-L-Fc融合蛋白的获得为研究新蛭素的长效剂型奠定了重要基础。