背景基于组织差异性DNA甲基化标记推断体液斑的组织来源是近年来法医学研究热点。DNA甲基化的组织特异性和稳定性是法医学应用的重要评估指标。基于组织差异性单CpG位点甲基化的体液推断方法,显示出较高的法医学应用价值。然而,单CpG位点甲基化较大的个体差异性降低了该方法的准确性,而区域甲基化单倍型模式具有更高的组织特异性和个体稳定性,有望成为更好的体液鉴定标记。MPS则是可深入分析组织差异性甲基化模式的技术方法,有助于探索出更好的体液鉴定标记。目的建立基于MPS的甲基化检测方法,探索不同体液特异性甲基化模式标记鉴别法医体液的准确性。方法构建亚硫酸盐转化扩增子测序文库,采用Miseq双端测序技术,对165例体液样本的41个体液特异性甲基化片段进行测序,运用生物信息学分析软件对测序数据进行甲基化分析,获取所有片段CpG位点的甲基化水平,筛选组织特异性强、稳定性好的甲基化标记建立体液推断随机森林模型,根据体液推断的准确性选出体液鉴定的最佳标记。结果所有样本片段的测序结果质量良好。大部分片段的CpG位点甲基化水平在每种体液中具有高度一致性,在靶体液与其它体液之间呈现显著性差异。基于其中9个片段的10个位点甲基化水平推断体液的准确性达到97.58%;基于9个片段的18个体液特异性更强的位点组成单倍型甲基化标记推断体液的准确率达到98.18%。基于所有片段的5个体液特异区分度最大的位点推断体液的准确率达到100%。结论基于MPS的甲基化检测方法可筛选出体液特异性更强的甲基化模式。多个组织特异性甲基化CpG位点组成的单倍型标记有助于提高基于DNA甲基化鉴定体液斑的准确性。