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紫杉醇是一种具有强大抗癌功效的萜类化合物,在红豆杉中含量极低。目前主要利用半合成、天然产物提取获得,市场供需矛盾激烈。基于合成生物学理念的异源生物合成是实现紫杉醇高量生产的途径之一,但其前提是彻底解析目标产物的代谢途径。羟化酶的克隆与羟化次序的确定是紫杉醇生物合成途径研究的热点和难点。本研究拟克隆中国红豆杉中新的羟化酶,并对其功能进行分析,取得以下结果:(1)中国红豆杉中新的羟化酶的克隆与分析。对实验室前期测定的红豆杉转录组数据进行分析,共发现了266个细胞色素P450酶基因序列片段,其中归属于CYP716和CYP725亚家族的基因片段39个。对其中4个包含完整的ORF的候选基因(cyp1,cyp2,cyp3,cyp4)进行了克隆,并对其同源性进行了分析,发现CYP1与来源于美国西加云杉的CYPA1同源性为71%,CYP2,CYP3,与T10H的同源性分别为70%,74%,CYP4与烟草中的CYP716B1同源性为45%。(2)4个候选羟化酶基因(cyp1,cyp2,cyp3,cyp4)的原核表达。将4个候选羟化酶基因利用合适的酶切位点分别构建至原核表达载体pET-32a。考察了IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等对蛋白表达的影响。结果表明,最佳诱导条件为:IPTG浓度0.08 mM,诱导时长5 h,温度20℃,诱导表达的蛋白以包涵体形式存在。(3)分别采用CO差光法和羟化酶体外反应体系对表达的羟化酶蛋白活性和功能进行分析。发现CYP2蛋白在CO吹泡后在450 nm附近没有明显紫外最佳吸收,暗示其可能没有活性;羟化酶体外功能研究反应体系由底物,酶蛋白,电子传递系统,NADPH再生系统及反应缓冲液构成。首先采用二氯甲烷/甲醇混合萃取获得紫杉烷混合物,进而用葡聚糖凝胶为介质制备TC,发现洗脱液(乙腈/水)中乙腈为70%时,可获取含量在90%以上的TC。结果发现,TC与CYP2反应后没有新峰出现,进一步证明了表达的羟化酶没有活性,对原因进行了简单讨论。