目的1.明确恩波吡维铵（Pyrvinium Pamoate,PP）在皮炎外瓶霉对ExtrR的影响;明确ExtrR在皮炎外瓶霉生长、毒力及体外药物敏感性中的作用;阐明ExtrR在PP单用及与唑类联合抗皮炎外瓶霉中的调控机制。2.筛选烟曲霉敲除株菌库中影响PP联合唑类协同效应的相关靶点。3.进一步分析烟曲霉敲除菌库中新型ABC转运蛋白ROA1在烟曲霉对唑类药物敏感性、生长和氧化应激的影响方法1.采用电穿孔法构建皮炎外瓶霉敲除株△ExtrR;运用微量液基稀释法检测PP与唑类联合的体外药物敏感性;运用E-test药物敏感性实验检测其对唑类药物的敏感性;通过生长曲线测定、菌落直径测量、真菌形态观察（小培养）等实验明确ExtrR在皮炎外瓶霉生长、毒力中的作用。2.参考美国临床实验室标准化研究所CLSI M38-A2、M44-A2方案,利用微量液基稀释棋盘法检测PP联合伊曲康唑（Itraconazole,ITR）,伏立康唑（Voriconazole,VOR）、泊沙康唑（Posaconazole,POS）的体外协同抗菌效应,筛选烟曲霉敲除菌库中逆转PP协同唑类菌株。进一步明确PP协同唑类抗真菌作用机制。3.利用高通量基因敲除技术制备原生质体法构建烟曲霉敲除株△ROA1,检测其对唑类药物体外药物敏感性;通过真菌形态观察（小培养）、渗透压测定、细胞内活性氧试验测定、氧化应激试验测定等实验明确△ROA1在烟曲霉生长、毒力中的作用;通过基因RT-PCR技术检测cyp51及MDR1、CDR1b、Srb A、Atr R等基因的表达,明确△ROA1耐药机制。结果1.与皮炎外瓶霉34野生株（WT）相比,△ExtrR敲除株较皮炎外瓶霉野生株WT生长缓慢;菌落直径无明显差异;E-test药物敏感性实验显示:ITR、VOR、POS对△ExtrR的MIC值均小于WT,△ExtrR对VOR的敏感性与野生株相比显著增强,有统计学意义（P＜0.05）;△ExtrR对ITR、POS的敏感性与野生株相比差异无统计学意义（P＞0.05）;PP与唑类联合药敏实验显示△ExtrR敲除株与野生株在体外均有协同POS抗真菌作用。2.微量液基棋盘法从烟曲霉敲除菌库中筛选出氧化还原酶,短链脱氢酶/还原酶家族超家族氧化物相关基因AFUA＿8G01550、MFS转运体相关基因3.AFUA＿2G05840、SET和WW结构域蛋白AFUA＿5G06000、FAD依赖性氧化还原酶相关基因AFUA＿7G05070敲除株可以逆转PP协同POS抗真菌作用4.与烟曲霉野生株WT相比,真菌形态观察（小培养）显示△ROA1较野生株产孢率较低;微量液基稀释法药敏实验显示△ROA1对ITR、VOR敏感性降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;E-test药物敏感性实验显示:△ROA1对ITR、VOR、POS的MIC值均大于WT,但差异无统计学意义（P＞0.05）。渗透压测定显示:在加入Na Cl后△ROA1和WT的菌落直径之间无明显差异（P＞0.05）。而在加入D-山梨醇之后,△ROA1的菌落直径明显大于野生株,对D-山梨醇敏感性下降,存在显著差异（P＜0.05）。细胞内活性氧试验测定显示:△ROA1和WT产生的活性氧无明显差异（P＞0.05）。氧化应激试验测定显示:过氧化氢组△ROA1和WT的菌落直径在0m M、0.2m M、2.5m M有显著差异（P＜0.05）,△ROA1菌落直径显著大于WT;甲萘醌组在0μM、5μM、15μM△ROA1菌落直径显著大于WT（P＜0.05）。RT-PCR显示:△ROA1的cyp51B、MDR4、Srb A基因表达量显著增加（P＜0.05）。结论1.在皮炎外瓶霉中ExtrR的缺失突变体△ExtrR对VOR的敏感性增强,ExtrR可能还影响了皮炎外瓶霉的生长速率及菌株形态;目前的实验结果尚不足以证明ExtrR参与了皮炎外瓶霉PP协同唑类抗真菌作用的机制,PP协同唑类抗皮炎外瓶霉的具体调控机制还有待进一步研究。2.短链脱氢酶/还原酶家族超家族氧化物相关基因AFUA＿8G01550、MFS转运体相关基因AFUA＿2G05840、SET和WW结构域蛋白AFUA＿5G06000、FAD依赖性氧化还原酶相关基因AFUA＿7G05070可能为PP协同POS抗烟曲霉作用靶点。3.烟曲霉中ROA1基因的缺失导致对唑类药物ITR、VOR的敏感性下降,其机制可能与△ROA1的cyp51B、MDR4、Srb A基因表达量显著增加有关,ROA1可能还参与了对菌丝产孢率,对氧化剂、渗透压稳定性的调节。