研究背景和目的慢性肾病(Chronic kidney disease,CKD)是心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的重要危险因素之一。CVD病死率占到CKD患者全因死亡人数的40%～50%。CKD患者出现心力衰竭、缺血性心脏病等CVD并发症与心室重构、动脉粥样硬化等基本病理改变密不可分。在CKD人群中,超过40%的患者出现左心室肥厚,并伴有心脏结构和功能的改变;动脉粥样硬化的发生率也高达30%,随着肾脏功能的恶化而不断加重。尽管CKD患者多伴随高血压、高脂血症、糖尿病等并发症,但这些传统危险因子并不能完全解释CKD患者高CVD发生率和病死率的现象。因此,CKD患者体内可能存在其他的CVD致病因素。尿毒症毒素是一组因肾功能下降而潴留于CKD患者体内的代谢终产物,对心血管系统的潜在毒性作用受到广泛的关注。其中,小分子蛋白结合类毒素主要包括酚类、吲哚类、马尿酸类、聚胺类、糖基化合物类、同型半胱氨酸等毒素,因其蛋白结合特性而无法通过常规透析治疗方法去除。多项临床研究分析显示,酚类毒素中的硫酸盐对甲酚(p-cresyl sulfate,PCS)与CKD患者CVD病死率有强烈的相关性,但其具体的毒性效应及致病机制尚未完全明确。本论文拟通过体内、外实验,研究PCS对心血管系统的潜在毒性效应及机制,为临床治疗CKD及干预CVD发生和发展提供理论依据。研究方法第一部分:1)通过5/6部分肾脏切除(Nx),结合PCS喂养,建立PCS升高的动物模型;采用超声心动图和心脏切片染色的方法,评价Nx和PCS对于心脏结构和功能的影响;2)体外培养H9c2细胞,通过流式细胞术、蛋白印迹、Caspase-3活性检测、免疫荧光等方法检测PCS对H9c2细胞的毒性作用;应用NADPH氧化酶/活性氧抑制剂(apocynin和NAC),进一步探究潜在的机制;3)建立PCS升高的动物模型,运用超声心动图来评价apocynin对于心脏功能的保护作用第二部分;1)选择5周龄APoE-/-小鼠,高胆固醇饮食,建立PCS升高的动脉粥样硬化动物模型;建模8周后,采用活体荧光显微镜和蛋白印迹技术,进一步研究PCS对白细胞-内皮细胞间粘附的影响;对主动脉大体和主动脉根部切片进行油红O染色,评价PCS对动脉粥样硬化斑块大小的影响;2)建模24周后,对主动脉根部冰冻切片进行组织学染色(油红O、MOMA-2、α-SMA、天狼猩红、MMP-2和MMP-9),评价PCS对于主动脉根部斑块组成成分及稳定性的影响;3)体外培养大鼠VSMCs,通过Transwell小室实验检测PCS对细胞迁徙能力的影响;利用蛋白印迹技术,半定量分析MMPs和TIMPs表达量的变化。研究结果第一部分:1)在体动物实验发现:对于5/6肾脏切除小鼠,PCS干预促进心肌细胞的损伤和凋亡,并引起心脏功能的改变,具体表现为二尖瓣血流频谱E峰速度(E)和A峰速度(A)比值的改变;NADPH氧化酶抑制剂Apocynin能够减轻PCS引起的E/A比值变化。2)体外细胞实验发现:中、高浓度PCS能够促进H9c2细胞的凋亡,并且引起NADPH氧化酶p22phox和p47phox亚基的表达增加,进而促进细胞内活性氧(ROS)的生成;Apocynin和NAC均能够抑制PCS引起的不良效应。第二部分:1)在体动物实验发现:经过8周的喂养,PCS干预引起小鼠主动脉斑块的生长;此外,PCS还促进了粘附分子的表达,并引起白细胞在内皮表面滚动和粘附的增加;经过24周的喂养,PCS干预引起斑块内组成成分的改变,引起斑块稳定的降低;2)体外细胞学实验发现:PCS能够促进血管平滑肌细胞的迁徙,并引起MMPs和TIMPs的失衡。研究结论1)PCS促进慢性肾病时心肌细胞的损伤和心脏组织的重构,并对心脏的舒张功能产生显著影响;该作用可能与NADPH氧化酶的激活和细胞内ROS生成增加有关。2)PCS促进动脉粥样硬化的生长和斑块不稳定性的增加;该作用可能与白细胞-内皮细胞粘附作用的增强,以及VSMCs细胞表型和功能的改变有关。