论文部分内容阅读
目的:研究二烯丙基二硫(Diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌细胞差异表达基因,绘制其差异基因表达图谱,寻找DADS作用人胃癌细胞的侯选相关基因,为揭示DADS抗胃癌机制,开拓人胃癌防治的新途经奠定基础。 方法:体外培养人胃癌MGC803细胞,倒置显微镜和光镜观察DADS处理MGC803细胞形态的改变;MTT比色法检测不同浓度DADS对MGC803细胞增殖活性的影响;碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测法观察DADS对MGC803生化代谢的作用;抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)、T/A克隆、测序以及生物信息学方法分析DADS诱导MGC803细胞过程中基因的差异表达。 结果:细胞形态学观察:30mg/L DADS处理MGC803细胞24h后,与对照组相比,胞浆丰富,细胞核变小,染色变淡,核仁数目明显减少,散在分布生长,部分细胞变圆,浮起。 MTT显示:10、20、30、40、50mg/L DADS对胃癌MGC803细胞增殖的抑制率分别为15.2%、26.2%、51.4%、57.3%、70.0%,呈浓度依赖关系。 ALP活性检测:ALP比活性呈浓度依赖性下降,10、20、30、40、50mg/L处理MGC803细胞后,其下降率分别为13.7%、25.6%、49.9%、66.5%、72.0%。 总RNA提取和mRNA纯化:提取的总RNA可见明显的28S、18S和5S的清晰无拖尾条带,mRNA为清晰“smear”带,无DNA和RNA污染。 SSH结果:连接效率检测,Rsa Ⅰ酶消化产物cDNA与接头连接效率大于25%;消减有效性实验,未消减样品在15次循环时即可见G3PDH阳性条带,消减产物在循环数达25-30次才见扩增产物,且产物量明显减少;巢式PCR产物分析显示,消减组产物片段明显少于未消减组产物片段,前者可见清浙的条带,