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由PCV2感染引起的PCVAD于2002年开始在我国各地呈暴发流行以来,至今成为危害我国养猪业的重要疫病之一。感染PCV2将导致猪免疫抑制,易继发或并发其他病原体,从而造成更大的经济损失。疫苗免疫是预防PCV2相关疾病的主要手段,目前临床应用的PCV2疫苗主要分为两类,全病毒灭活苗和基因工程亚单位疫苗,尽管具有较好的安全性,但是达不到理想的免疫保护效果。因此国内外许多研究人员进行了新型PCV2疫苗的研究,包括弱毒疫苗、DNA疫苗等。本试验研究将利用基因工程技术制备复制缺陷PCV2病毒,为开发新型PCV2基因工程疫苗奠定了前期实验室研究基础。1 p IRES2-CAPopt表达载体的构建根据家猪的密码子偏好,对CAP基因的ORF序列进行重新编码并人工合成,通过上游引入BglⅡ位点、下游引入Not I位点克隆于p UC载体。p UC-CAPopt质粒和p IRES2-EGFP质粒通过BglⅡ和NotⅠ进行双酶切,分别获得CAP小片段和p IRES2载体大片段,再通过T4 DNA连接酶连接、转化,获得p IRES2-CAPopt表达载体。将p IRES2-CAPopt进行酶切鉴定,结果显示,CAP基因约700bp,p IRES2载体约4000bp,片段大小与预期结果相同,表达载体构建成功。2 CAP反式互补转基因PK15细胞株（CTC-PK15）的构建用无内毒素p IRES2-CAPopt质粒瞬时转染96孔板PK-15细胞,间接免疫荧光试验（IFA）验证载体中CAP的表达功能。p IRES2-CAPopt稳定转染24孔板PK-15细胞,稀释至1000-2000个/m L,不同浓度梯度G418筛选10-14d,确定PK-15细胞的最适筛选浓度。p IRES2-CAPopt稳定转染6孔板PK-15细胞,700 ug/ml G418加压筛选至无细胞死亡,极限稀释法挑选单克隆细胞后进行IFA验证。结果显示,p IRES2-CAPop瞬时转染细胞荧光率达10%,表明根据家猪密码子偏好重新编码的CAP基因插入p IRES2-CAPopt载体中能在PK-15细胞中正常表达。p IRES2-CAPopt稳定转染PK-15细胞后经G418加压筛选和极限稀释法单克隆筛选,获得CAP反式互补转基因细胞CTC-PK15。3复制缺陷PCV2感染性克隆p PCV2-M3的构建运用线性PCR重组技术,以p Omni为载体克隆PCV2基因组DNA,构建获得感染性克隆p Omni-PCV2。通过DNA定点突变技术将p Omni-PCV2载体上CAP基因的138、139、140连续3个氨基酸密码子突变为终止密码子,构建突变病毒感染性克隆p PCV2-M3。菌液PCR鉴定结果表明感染性克隆p Omni-PCV2构建成功。突变的p PCV2-M3感染性克隆测序结果显示CAP中连续3个氨基酸密码子成功突变为TAA、TAG、TGA三个终止密码子。4复制缺陷病毒PCV2-M3的拯救用p PCV2-M3感染性克隆转染CTC-PK15细胞,G418维持浓度下盲传12代,收获PCV2-M3病毒,特异性PCR扩增显示病毒DNA逐代增多,证明复制缺陷病毒PCV2-M3拯救成功。将已知滴度的PCV2病毒(TCID50=10~5)DNA 10倍梯度至10-6,以不同稀释度DNA为模板进行PCR扩增,观察PCR结果中扩增阳性的最高稀释度与TCID50的对应关系。提取盲传12代的PCV2-M3病毒DNA 10倍梯度稀释后进行PCR扩增,与PCV2病毒模板扩增结果比较来估计PCV2-M3的病毒滴度。结果显示,PCV2病毒模板扩增阳性的最高稀释倍数为10-5,而PCV2-M3病毒扩增阳性的最高稀释度为10-4,因为PCR模板与IFA法测定病毒滴度时都是10倍梯度稀释,因此估计PCV2-M3病毒的TCID50约为10~4。5复制缺陷病毒PCV2-M3的增殖缺陷验证用拯救的PCV2-M3病毒分别感染PK-15细胞和CTC-PK15细胞并盲传3代,收获两种细胞的裂解液提取病毒DNA,通过特异性PCR验证PCV2-M3病毒在正常PK-15细胞中的复制缺陷特性。结果显示PCV2-M3病毒感染CTC-PK15细胞后1-3代盲传细胞裂解液均能扩增出特异性条带,而PCV2-M3病毒感染PK-15细胞后只有P1代细胞裂解液有扩增条带,P2、P3代细胞裂解液均无扩增条带,表明PCV2-M3病毒对正常PK-15细胞具有感染性,能感染进入PK-15细胞,但不能产生子代病毒从而感染下一代细胞。用PCV2-M3病毒感染CTC-PK15细胞,连续传代30代,每10代收获一次病毒感染PK-15细胞后通过IFA验证PCV2-M3病毒是否发生回复突变。结果显示PCV2-M3病毒在CTC-PK15细胞中连续传30代后在PK-15细胞中仍为复制缺陷病毒,表明其没有发生回复突变,说明本研究设计构建的PCV2-M3病毒的三个终止密码子在病毒传代过程中发生回复突变的可能性极低,具有作为候选疫苗的良好安全性。