论文部分内容阅读
在全球范围内消灭脊髓灰质炎是人类的共同目标。随着野生型脊髓灰质炎病毒（PV）引发病例的逐渐减少，疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒（VDPV）日益受到人们的重视。近年来，由脊髓灰质炎病毒疫苗株（V）和其它非脊髓灰质炎型肠道病毒（NPEVs）通过在自然界基因重组形成的嵌合病毒（V／NPEV）导致的疫苗相关麻痹型脊髓灰质炎（VAPP）病例报告数不断增加。 对脊髓灰质炎病毒这种新出现的重组现象进行全面而深入的研究，将有助于我们了解自然界病毒变异的机理和规律，及时掌握脊髓灰质炎病毒疫苗株变化的新趋势，为防止此类疫苗重组病毒出现及全世界消灭脊髓灰质炎目标的实现提供理论支持。 为此，我们构建了以pcDNA3为载体，包含脊髓灰质炎病毒疫苗株（SabinI）5’非编码区（5’NTR）和衣壳蛋白区（P1区）基因，柯萨奇病毒B3型（CVB3）P2区基因，脊髓灰质炎病毒疫苗株（SabinI）P3区和3’非编码区（3’NTR）基因的重组真核表达质粒pSCS。利用LipofactamineTM-2000将这种质粒转染真核细胞KMB-17后，我们发现少数细胞肿胀，变圆甚至脱落，部分细胞凝缩并呈葡萄状堆积在一起。电子显微镜下这些转染的细胞内溶酶体增多，线粒体肿胀、嵴断裂并发生空泡样变。盲传的细胞也发生了和转染细胞相类似的变化。在这两种细胞内我们还同时观察到了病毒样颗粒（VLP），利用免疫电镜进一步证实了这些颗粒的存在。RT-PCR实验表明重组质粒在转染细胞内得到了转录。通过免疫沉淀实验我们检测了重组质粒转染细胞后不同标记时间病毒蛋白的表达情况，在35S-Met标记后8h、16h、24h、36h均观察到了VP0蛋白条带。通过蔗糖密度梯度离心和液闪仪计数实验我们还对pSCS质粒转染KMB-17细胞后可能的病毒颗粒形成过程进行了分析，发现转染细胞内标记蛋白的动态变化过程与脊髓灰质炎病毒疫苗株在正常细胞内的复制和装配过程类似。利用从转染细胞中提取的蛋白制备抗体并进行中和实验，结果表明，这些抗体对PV1的攻击发挥了一定的中和作用，但不能保护细胞免受CVB3的感染。 通过以上实验，我们对嵌合病毒基因的表达、多蛋白的剪切、病毒复制过程中蛋白质间的相互作用有了进一步的认识，为深入研究病毒重组现象积累了必要的实验资料，也为今后相关工作的开展奠定了基础。