在全球范围内,肺癌是最常见也是最致命的恶性肿瘤。根据中国国家计生委的数据显示,我国的肺癌发病率目前正以每年26.9%的速度增长,在过去的50年中,每10到15年肺癌患者的人数就增加一倍。我国第三次居民死亡原因调查结果显示,过去三十年间肺癌死亡率上升了465%,从而取代肝癌成为了中国致死率最高的恶性肿瘤。肺癌的病因至今尚不完全明确,但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。因治疗方式有所不同,肺癌可分为两大类:小细胞型肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中非小细胞型肺癌更为常见,目前约占肺癌患者的87%,约75%的患者发现时已处于中晚期,5年生存率极低,完全失去了手术根治的机会。因此,以放疗为主的综合治疗模式在NSCLC的治疗过程中就占据了重要地位。数据显示:约60%的患者在治疗不同阶段会应用该种治疗方法,但多数患者会出现不同程度的辐射抵抗,治疗效果不尽如人意。由此可见,如何增加NSCLC的辐射敏感性、克服其辐射耐受则是增强放射治疗效果最直接、最切中要害的研究思路,是肺癌放疗领域亟待解决的科学问题。越来越多的研究表明,组织型谷氨酰胺转移酶2(Transglutaminase 2,TG2)在肺癌的发生发展中发挥着十分重要的作用,可能成为肺癌放疗增敏的新靶点。TG2是谷氨酰胺转移酶家族成员中研究较为广泛和深入的多功能蛋白,其主要功能是通过氨基酸共价交联机制,催化Ca2+依赖的翻译后蛋白修饰,同时,TG2又具有GTP/GDP结合活性、蛋白二硫键异构酶活性和蛋白激酶等活性功能,从而参与多种生理病理过程,如组织纤维化、细胞凋亡、细胞自噬、EMT等。研究表明Ca2+是TG2发挥转氨基作用的重要激活剂,高Ca2+浓度下TG2转氨酶活性被激活,其他活性被抑制;而在低Ca2+浓度下TG2即会发挥其他功能活性,这与TG2空间构象的改变密切相关。TG2大部分分布于细胞质内(70%),约20%分布于细胞膜,仅有少量分布于细胞核(约5~7%)。目前发现,TG2在某些肿瘤的发生发展及转移恶化等过程中起到重要作用,癌细胞中TG2表达程度的不同与疾病的进程联系紧密。众多研究已经表明,TG2在肺癌、卵巢癌及乳腺癌等大部分肿瘤组织中均有较高表达,且高表达TG2的肺癌患者较低表达TG2肺癌患者的生存率低。最近也有研究显示,TG2可能参与DNA损伤修复的调控而在化疗药物的抵抗中发挥重要作用。但是TG2在肿瘤放射治疗方面的研究少之又少,更没有研究表明其在电离辐射造成DNA损伤修复中的作用。众所周知电离辐射造成细胞死亡的主要原因就是其对细胞DNA的损伤,故DNA损伤修复通路是研究辐射增敏及辐射防护的重要方向,因此TG2在肿瘤放疗中起到的作用及其在DNA损伤修复通路中的作用成为了本课题研究的重中之重。在本研究中,我们首先通过体内外模型发现抑制TG2具有显著的放射增敏效果。在体外实验中,我们利用Westernblot法对不同NSCLC细胞(A549,H1299,H460)、路易斯肺癌细胞(LLC)及人正常支气管上皮细胞BEAS-2B进行TG2蛋白含量检测,明确肺癌细胞TG2蛋白含量显著高于正常支气管上皮细胞。然后我们采用Annexin V细胞凋亡流式分析方法发现抑制TG2后进行照射,A549细胞凋亡率明显增加,而人正常支气管上皮细胞BEAS-2B无明显影响。进一步我们对不同NSCLC细胞(A549,H1299,H460)通过TG2siRNA或葡萄糖胺抑制TG2后进行克隆形成率实验,结果显示不同NSCLC细胞系不同抑制方式下,抑制TG2后细胞辐射敏感性均明显增高。在体内实验中,我们利用TG2抑制剂葡萄糖胺检测原位荷瘤小鼠的辐射敏感性,发现使用葡萄糖胺组的原位荷瘤小鼠照射后生存期明显延长,肿瘤显著缩小,辐射敏感性大幅提升,对肿瘤切片进行TUNEL及Ki67染色后发现,给药照射组肿瘤细胞较单纯照射组细胞凋亡率明显增加;其次,我们使用临床患者的肺癌样本及肺癌患者数据库,进一步明确了TG2表达与NSCLC患者预后之间的关系,证实TG2高表达严重影响肺腺癌患者预后。通过上述体内外实验,我们明确了抑制TG2在非小细胞肺癌放疗增敏中的重要作用。为了明确抑制TG2在非小细胞肺癌发挥放疗增敏作用的分子机制,我们采用中性彗星电泳实验进行分析,结果发现抑制TG2后NSCLC细胞照后DNA损伤明显加重。而通过Westernblot及免疫荧光实验发现,抑制TG2后照射引起的γ-H2AX磷酸化水平时间明显延长,非同源重组末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)两条DNA损伤修复通路的蛋白磷酸化(DNA-PKcs、ATM、ATR、Rad51)大幅降低,由此表明TG2在DNA损伤修复通路存在着重要作用。更为有趣的是,我们通过Westernblot及免疫荧光实验发现,电离辐射会导致细胞质内TG2大量进入细胞核,30min达到最大,8h后核内TG2会逐渐出核。进一步我们采用激光照射的实验方法对细胞核进行点状打击后发现,TG2募集到了DNA损伤修复位点,这就说明了TG2很有可能直接参与到了DNA损伤的修复过程,更加明确了TG2在DNA损伤修复通路中发挥着重要作用。更进一步,我们通过对照后细胞核内DNA结合蛋白和非DNA结合蛋白分离后发现,TG2在照后10min就已经开始结合在DNA上,而在照后2h TG2逐渐脱离DNA,4h TG2在细胞核内非DNA处达到最多。上述实验我们已经证明了抑制TG2在非小细胞肺癌中发挥放疗增敏作用是通过DNA损伤修复通路。为了进一步寻找TG2介导DNA损伤修复及辐射耐受的直接作用蛋白,我们使用免疫共沉淀和蛋白质谱技术,鉴定出134个照后与TG2相互作用的蛋白,并做了初步验证,结合文献调研和实验验证,我们最终锁定TOPOⅡα作为TG2的下游效应分子,进一步通过免疫共沉淀验证,结果显示照射后TG2明确与TOPOⅡα结合,且在TOPOⅡα敲低细胞中,我们发现照后DNA损伤加重且修复缓慢,而葡萄糖胺对TOPOⅡα敲低细胞的DNA损伤无明显的影响。Rescue实验显示,TOPOⅡα过表达显著激活了TG2敲除细胞中的DNA损伤修复通路,但TG2过表达并不影响TOPOⅡα敲除细胞的DNA损伤修复通路的活化。为了寻找TG2与TOPOⅡα作用的确切功能域,我们构建了TG2核心功能域缺失及核心功能点突变的细胞系,并进行了免疫共沉淀实验,发现任一功能域缺失都会影响其与TOPOⅡα的结合,而TG2 W241突变可能会影响TG2与TOPOⅡα的相互作用,提示TG2转氨基活性可能在TG2-TOPOⅡα信号通路发挥关键作用。总之,本研究首次证实抑制TG2对非小细胞肺癌的放射增敏作用,明确了TG2可通过对NSCLC细胞中DNA损伤修复的调控产生直接相关作用,并发现TG2的直接作用蛋白为TOPOⅡα,其转氨基活性可能在TG2-TOPOⅡα信号通路发挥关键作用。这些研究结果为肺癌放疗增敏研究寻找到了新的分子靶点,为增加肺癌细胞放疗敏感性提供了新的方向和手段,在临床上改善放疗治疗效果方面具有重要意义。