开发盐藻作为生物反应器，可以生产具有药用价值的蛋白质如抗肿瘤药物血管抑素等。在转基因盐藻(TransgenicDunaliellasalina)研究中，特别是利用盐藻生物反应器表达外源基因时，从大量未转化细胞背景中筛选并获得稳定转化子，必须依赖于有效的选择标记。目前，有关盐藻选择标记的研究较少，主要有除草剂、抗生素抗性基因等研究。这些选择标记在利用盐藻作为生物反应器大规模表达外源蛋白时具有一定的缺陷：如除草剂本身可能造成一定的环境污染，除草剂抗性基因可能会经自然杂交传递至杂草；转基因食品中的抗生素抗性基因可能造成人类对这些抗生素产生抗性等。因此，在盐藻生物反应器的建立过程中，选择合适的选择标记进行转基因研究是迫切而必要的。 植物中的硝酸盐还原酶(nitratereductase，NR)作为限速酶，催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，这一过程在氮代谢中处于关键地位，对植物生长发育、产量形成有重要影响。目前已有多种真菌和微藻利用NR基因作为选择标记进行了转基因的研究。与除草剂、抗生素等抗性选择标记相比，NR基因作为选择标记具有下列优点：1.遗传上比较稳定，转化效率较高；2.筛选简单：在含硝酸盐的培养条件下，NR缺陷型突变藻株能够抗氯酸盐毒性，而野生藻株不能抗氯酸盐毒性，因此通过氯酸盐抗性进行筛选，可以较为容易的得到NR缺陷型突变株；3.转化NR缺陷型突变藻株后，非转化株在硝酸盐培养的条件下不能生长，因此未转化细胞背景低；4.NR基因为硝酸盐诱导型基因，便于遗传操作；5.成本较低，对环境无污染等。因此在转基因盐藻研究中，NR基因是更加适合盐藻自身的、安全的选择标记基因，对今后建立杜氏盐藻遗传转化系统，使外源目的基因在其中稳定表达、生产目的基因产品具有十分重要的意义。 建立NR基因选择标记是通过克隆NR基因，并将该基因转化NR基因缺陷型突变株，使突变株恢复野生型NR活性而建立选择体系。目前，本研究室谢华等已完成杜氏盐藻NR基因的克隆、鉴定和载体的构建工作；贾岩龙等初步建立了杜氏盐藻NR缺陷型突变体藻株的诱变、筛选和鉴定方法。本论文主要完成杜氏盐藻NR完全缺陷型突变藻株的筛选和在基因水平上的鉴定工作，为最终利用NR基因建立杜氏盐藻专用筛选标记奠定基础。 实验方法 1.杜氏盐藻氯酸盐抗性突变藻株的筛选和分离 1.1乙基亚硝基脲(ENU)诱变杜氏盐藻 利用化学诱变剂ENU可引起大量随机单碱基突变的机制，采用低浓度(0.25-0.50mmol/L)、长时间(10d)诱变的方法对生长至对数生长期的杜氏盐藻进行诱变。实验设阴性、阳性对照组和诱变组：阴性对照组为野生型盐藻，不进行ENU诱变，也不进行氯酸盐抗性筛选；阳性对照组盐藻，不进行ENU诱变，但进行氯酸盐抗性筛选。诱变组经过诱变之后得到是一个含有各种突变的突变株文库。 1.2杜氏盐藻氯酸盐抗性突变藻株的筛选 利用NR突变株具有氯酸盐毒性抗性的特点对经ENU诱变的盐藻进行液体筛选和培养皿固体筛选。①液体筛选：诱变后的盐藻在加入终浓度为200mmol/LNaClO3的PKS培养液中筛选培养10d，然后分别改用以2.5mmol/L尿素和5.0mmol/L亚硝酸钠为氮源的PKS培养液恢复培养。共进行十次液体筛选，随后进行培养皿固体筛选。②培养皿固体筛选：培养皿筛选分两部分进行，培养皿氯酸盐抗性实验和不同氮源固体培养基生长实验。a.培养皿氯酸盐抗性实验：将经过液体筛选的诱变组盐藻和野生型盐藻分别在含100mmol/L的NaCl03固体筛选培养基(PKS培养液+10g/L琼脂)上划线筛选。b.不同氮源固体培养基生长实验：从固体筛选培养基上挑取氯酸盐抗性突变藻落，分别用以2.5mmol/L尿素和5.0mmol/L亚硝酸钠为氮源的PKS培养液恢复并扩大培养。随后将其分别在含相同氮源的PKS固体筛选培养基上划线。共进行十次培养皿固体筛选，最后挑取生长良好的藻落，用含相同氮源的PKS培养液扩大培养，得到氯酸盐抗性突变株库。 1.396孔板培养单细胞藻株 由于固体培养基上挑出的藻落可能不是来自一个单细胞，为了得到基因型一致的突变株盐藻，作者采用96孔板法分离单细胞藻株。将生长至对数生长期的氯酸盐抗性突变株库盐藻细胞计数，然后稀释到8个细胞/3mL，每个库用一个96孔板，每孔300νL，加入到96孔板培养。等各孔盐藻细胞生长至一定程度(各孔转绿)后，改用含各自氮源的PKS培养液扩大培养。得到各种氯酸盐抗性突变株单细胞藻株库。 2.杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株的分离和验证 2.1杜氏盐藻氯酸盐抗性突变藻株NR活性的测定 按改进的对氨基苯磺酸(磺胺)-α-萘基乙烯二胺法，测定所分离的各氯酸盐抗性突变藻株的NR活性，挑选出NR活性为零的突变株，反复检测其NR活性，验证其NR活性丧失的稳定性，将确定NR活性缺失稳定的突变藻株扩大培养，即为NR缺陷型突变藻株。 2.2杜氏盐藻NR缺陷型突变株氯酸盐抗性试验 分别用含NaClO3浓度梯度200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、800mmol/L、1600mmol/L的PKS培养液培养NR缺陷型突变株，验证其高浓度氯酸盐培养液中的氯酸盐抗性。以野生型和非完全突变株做阳性对照，野生型在不含氯酸盐的PKS培养液培养作阴性对照。并且用含200mmol/LNaClO3的野生型致死量的固体培养基验证NR缺陷型突变株的氯酸盐抗性的稳定性。 2.3杜氏盐藻NR缺陷型突变株不同氮源生长实验及生长特性实验 分别以硝酸盐、亚硝酸盐为氮源的液体和固体PKS培养基及无氮固体PKS培养基培养NR缺陷型突变株，观察它们在不同氮源中的生长情况，以野生型为对照。将新接种的盐藻培养10天，每天观察其细胞形态、活动度及682nm处的吸光度值，与野生型为对照，观察其生长情况与野生型的区别。 3.杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株NRcDNA片段的克隆与序列分析 根据GenBank上登陆的杜氏盐藻NR的cDNA序列设计三对PCR引物，利用PCR的方法分三段扩增得到了杜氏盐藻NR缺陷型突变株NR基因全长cDNA片段，将其插入克隆载体pMD-19，转化大肠杆菌JMl09，经氨苄青霉素抗性和蓝白斑试验筛选阳性克隆，提质粒酶切鉴定重组质粒。对含有目的插入片段的阳性克隆菌落分别送四家基因公司进行基因序列测定，软件分析测序结果。 实验结果 1.杜氏盐藻氯酸盐抗性突变藻株的筛选和分离 1.1杜氏盐藻的氯酸盐抗性筛选结果 盐藻经液体氯酸盐筛选后，诱变组生长较好，藻液呈绿色；阳性对照组逐渐发黄、发白，藻体沉淀聚集，最后分解死亡；而阴性对照组生长良好。经过液体筛选的突变盐藻能够在含100mmol/L的NaClO3固体筛选培养基(PKS培养液+10g/L琼脂)上生长出单藻落，且藻落较多，但野生型盐藻没有藻落长出。诱变组盐藻在以硝酸盐为氮源的固体PKS培养基生长受到明显抑制，藻落发黄且细小呈针尖样，在以尿素或亚硝酸盐为氮源的固体PKS培养基上生长较好，呈绿色且藻落较大。而阴性对照组均生长良好。 1.296孔板培养单细胞藻株结果 96孔板中的单细胞藻群生长较慢，30天时有个别孔开始转绿，每个96孔板上的转绿孔数不等，最少的3孔，最多的31孔，各转绿孔的位置呈随机性分布。第50天时开始将各96孔板中转绿孔的盐藻扩大培养。 2.杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株的分离和验证 2.1杜氏盐藻氯酸盐抗性突变藻株NR活性测定结果 通过初步对各种单细胞藻株NR活性测定，得到4株NR活性为零的突变株盐藻，随后连续3次NR活性的检测结果表明其中3株的NR活性缺失稳定。并且在以后的随机检测中这3株突变株也显示出了稳定的NR活性丧失。因此可以认为这3株突变株盐藻即为NR完全缺陷型突变藻株。 2.2杜氏盐藻NR缺陷型突变株氯酸盐抗性试验结果 NR缺陷型突变株盐藻在各氯酸盐梯度的PKS培养液中生长良好，在最高浓度NaClO3(1600mmol/L)中藻液呈绿色，与野生型阴性对照相同。阳性对照组的野生型盐藻均死亡，而非完全突变株藻液随氯酸盐的浓度增加和培养时间的延长而逐渐变黄。 2.3杜氏盐藻NR缺陷型突变株不同氮源生长实验及生长特性实验结果 NR缺陷型突变株在含亚硝酸盐的固体和液体培养基上生长良好，在含硝酸盐的液体培养基中藻液逐渐变黄生长明显受到抑制，而在含硝酸盐的固体培养基上未见藻落长出；野生型盐藻在硝酸盐和亚硝酸盐的固体和液体培养基上均生长良好。 结论： 1.完善了杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株诱变、筛选、分离和鉴定的步骤和程序。 2.通过筛选和鉴定，共得到了3株NR活性完全丧失的突变藻株。序列分析表明，3株突变株共有11处相同的突变，其中的3处点突变引起了氨基酸性质的改变。它们均在近3’端有一段相同的移码突变，造成19个氨基酸的完全改变。此外，2株还分别由于在1235和1639位的点突变而产生了一个终止密码子。这些序列改变为它们的NR活性的丧失提供了证据。 3.杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株在硝酸盐固体培养基上不易生长，可以利用固体培养基进行转化藻株的筛选，即用野生型的杜氏盐藻NR基因转化NR突变株盐藻，使其恢复NR活性而能在以硝酸盐为氮源的PKS固体培养基中生长，从而建立筛选体系，为最终利用NR基因建立杜氏盐藻专用筛选标记奠定基础。