脊髓损伤后的神经功能恢复一直神经科学领域研究的一个难点，到目前为止尚未取得突破性进展，临床上亦缺乏有效的治疗措施，其主要原因在于：脊髓损伤后的原发和继发反应及修复机制相当复杂，目前了解尚少；神经元损伤后的再生能力有限，尚未发现能够有效促进神经再生的手段；再生的神经轴突缺乏有效的神经传导功能等。但是，经过许多科学家的努力，神经科学的研究取得了长足的进步，发现了许多对神经有保护和营养作用的物质，如NGF、BDNF、NT-3等，神经细胞黏附分子L1(L1)即是其中一员，它是在20世纪80年代发现的具有促进神经再生作用的物质，它在神经元、雪旺细胞、肠上皮细胞及部分肿瘤细胞等组织中广泛存在，能介导神经细胞与神经细胞之间的粘附，在神经轴突的生长、聚集，神经细胞的转移，纤维髓鞘的形成，神经通路的构建及信号的转导，抑制神经细胞的凋亡甚至在免疫系统、肿瘤的发生等方面均具有非常重要的作用。研究人员发现，在L1复杂的结构中，其特定的结构域片段同样具有较强的促神经生长或粘附的生物学活性，而片段蛋白具有可溶性和远处转运的特点，有希望用于治疗脊髓损伤和神经系统疾病，因此对于其片段结构的功能及机制的研究成为L1研究领域的主要方向。目前，国内外对于其胞外段免疫球蛋白样结构域Ig(1-4)的体外和体内研究尚未类似报道，即使是其他结构域片段亦主要是从细胞学功能方面着手。如通过该研究能够取得并发现该片段具有促进神经生长功能，则为其将来用于临床治疗相关疾病提供了实验依据，并为其进一步研究作用机制打下基础，有助于L1的进一步深入研究。 PC12细胞是一个因具有多项分化能力而被广泛应用于观察神经生长、营养因子作用的细胞模型。该细胞在不同的细胞外环境下可以增殖活分化成不同的表现形式。在正常的完全培养基中，PC12细胞进行正常的有丝分裂，但在神经生长因子(NGF)等的作用下，细胞将停止分裂而向神经元细胞分化，既往的研究发现L1分子在NGF的协助下将促进PC12细胞的生长，本研究利用这种特性进行融合蛋白的促神经生物学活性检测。同时，利用该研究中最为重要的第二军医大学博士论文中文摘要靶器宫—脊髓神经元进行了体外细胞培养的融合蛋白的活性测定。 本研究以新生4天SD大鼠海马为组织来源，采用R{pPCR技术获取总RNA、Ll cDNA，，再利用PCR、酶切、酶连等重组DNA技术成功构建pET28(+)L1一Ig(1一4)表达质粒，在大肠杆菌中实现了L1一19(1一4)融合蛋白的高效表达，并通过金属鳌合和层析技术纯化重组蛋白，利用PC12和脊髓原代神经元的培养来测定其生物学活性。通过改良Anen，s脊髓打击模型和蛛网膜下腔埋管的方法实现局部定期给药，并通过脊髓残留面积、行为学测试、电生理、NF免疫组化染色和Western blot以及H即逆行示踪等手段观察神经的修复效果。 本实验主要的主要研究结果如下: 1.成功获得了L1一Ig(1一4)基因并构建了Ll一Ig(1一4)的原核表达载体 以新生4天SD大鼠海马为组织来源，通过R下PCR方法扩增出Ll cDNA，经过基因测序表明所获得基因即为所需要的目的片段，未出现基因突变。利用PcR、酶切、酶连等重组DNA技术将L1一Ig(1一4)基因克隆至含T7启动子的质粒pET-28a(+)中，成珊勾建表达质粒pET28(+冲1一19(1一)。 2.取得了高纯度并具有生物活性的Ll一19(1一4)融合蛋白 将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选后获得表达菌株BL-L1一Ig(1为。表达菌株经lmM IPTG诱导3巧h后，SDs一PAGE检测到有约45kD大小的Ll一Ig(1一4)融合蛋白表达，并形成包涵体。凝胶自动扫描分析表明，L1一Ig(1一融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的28.3%，通过溶解、N产+一N伙树脂纯化并在NiZ+一柱上复胜后，获得纯度达90%以上的L1一Ig(1一4)融合蛋白。 在有复性后的L1一Ig(1一4)融合蛋白存在条件下，可以观察到体外培养的脊髓原代神经元轴突的生长得到明显增强，而在没有NGF的协助下，并没有观察到Ll一Ig(1一融合蛋白对PC12细胞有促进分化现象，表明该融合蛋白独自不具有促进PC12细胞分化的能力，但可以促进脊髓原代神经元的生长。 3.建立了改良A1len’s打击、蛛网膜下腔埋管模型 用体重在230士209的SD大鼠建立Tg脊髓中度打击损伤模型(10 X 4 gcf)，并且自助节段进行椎管内的蛛网膜下腔埋管(PE一10聚乙烯管)，将管的近端送至接近脊髓损伤节段，局部固定后进行隔日给药(7 .su留次)，持续10天。 4.行为学观察 通过改良Rivlin法斜板试验及BBB评分法对大鼠肢体功能进行研究，结果第二军医大学博士论文中文摘要显示:脊髓损伤以后，大鼠在短时间内双下肢的运动功能丧失，在3一袄左右，大鼠的下肢肌力开始逐渐恢复，但在2周以前实验组和对照组之间无统计学差异。在2一调时，实验动物行为功能恢复幅度加大，实验组工P评分和BBB评分均显著高于对照组。在5一8周时，功能恢复减慢，曲线上升缓慢，实验组行为学评分值仍较对照组高，并有统计学意义。 5.电生理学检测 通过对大鼠的MEP进行监测，结果显示:脊髓损伤以前的大鼠及假手术组的MEP波形一致，脊髓打击损伤?