β-羟丁酸脱氢酶2（β-hydroxybutyrate dehydrogenase 2,BDH2）是短链脱氢酶/还原酶家族成员,可以催化哺乳动物铁载体生物发生中的限速步骤,在细胞内铁稳态、能量代谢以及凋亡中起着重要的作用。然而,Bdh2基因在胚胎干细胞中的功能还未见报道。新型胚胎干细胞系（Advanced embryonic stem cells,ASCs）是本实验室建立的一种具有更高分化潜能的干细胞系,单个ASCs细胞即可贡献到胎儿组织、生殖嵴和卵黄囊。为了探究Bdh2基因在小鼠胚胎干细胞多能性和细胞命运决定中的作用,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,分别在ASCs和传统的胚胎干细胞系（Embryonic stem cells,ESCs）中同时靶向敲除Bdh2基因,进而探究Bdh2基因缺失的影响。本研究共分为四个部分,主要研究结果如下:一、Bdh2基因纯合敲除胚胎干细胞系ASCs和ESCs的建立及特性鉴定利用CRISPR/Cas9基因编辑技术共获得了7个Bdh2基因纯合缺失的ASCs、1个Bdh2单等位基因缺失的ASCs和2个Bdh2基因纯合缺失的ESCs,且敲除细胞系中均检测不到BDH2蛋白的表达,证明BDH2功能丧失。ASCs和ESCs两个细胞系的敲除细胞建系效率分别为8.2%和2%。通过形态观察、核型鉴定、AP染色、生长曲线绘制、细胞周期分析以及多能基因和分化基因的表达分析得出结论:Bdh2基因对小鼠胚胎干细胞的形态及多能性的维持不是必需的;Bdh2基因可能通过影响胚胎干细胞的细胞周期分布进而影响细胞的增殖速度;值得注意的是,Bdh2基因缺失的ASCs和ESCs中,内胚层基因Gata4,Gata6和Sox17在转录水平,甚至是蛋白水平,都表现出显著的高表达。相反地,中胚层基因Brachyury（T）,Evx1和外胚层基因Cdx2的表达均显著降低。这些结果表明,Bdh2基因可能参与细胞命运决定过程中各胚层的定向转录调控。二、Bdh2基因缺失的ASCs细胞的分子特征分析本实验将对照组ASCs和Bdh2基因缺失的ASCs进行了RNA-Seq分析,比较转录组分析证明了Bdh2基因缺失使胚胎干细胞ASCs具有一种独特的分子特征。首先,差异表达基因的筛选发现:内胚层谱系基因Gata4,Gata6,Sox7,Sox17和Pdgfrα在Bdh2基因缺失的ASCs中表达显著升高,与干细胞命运决定和内胚层形成及发育相关的通路也得到了显著富集,进一步证实了Bdh2基因在胚胎干细胞内胚层分化中可能存在作用。其次,我们首次系统分析了转录水平上Bdh2基因缺失对胚胎干细胞代谢过程的影响。结果表明:Bdh2基因缺失的ASCs中表达下调的差异基因显著富集到了若干代谢过程中,这些代谢过程分别涉及到了四种大分子物质代谢:氨基酸代谢、糖代谢、脂代谢和核苷酸代谢,经过分类和汇总,我们的分析初步表明,Bdh2基因缺失影响胚胎干细胞的上述代谢过程。三、Bdh2基因缺失对胚胎干细胞甲基化的影响本实验检测了几种甲基转移酶在转录水平及蛋白水平的表达,结果表明:Bdh2基因缺失会抑制胚胎干细胞ASCs中甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B和DNMT1的表达。同时,Bdh2基因缺失还会引起细胞内氧化应激的升高和m TORC1信号通路活性的增强。关于Bdh2基因调控胚胎干细胞DNA甲基化水平、氧化应激和m TORC1信号通路的具体机制还需要进一步探究。四、Bdh2基因缺失对胚胎干细胞ASCs和ESCs体内外分化的影响本实验对Bdh2基因缺失的ASCs和ESCs进行体外拟胚体分化实验和原始内胚层定向分化实验,结果表明:Bdh2基因缺失促进小鼠胚胎干细胞向内胚层的分化。另外,Bdh2基因缺失的胚胎干细胞分化形成的EB球与对照组胚胎干细胞分化形成的EB球表现出表型上的差异,包括EB球直径大小、数量及结构致密性上的不同,经实验推测可能与Bdh2基因的抗凋亡功能相关。最后,对Bdh2基因缺失的ASCs进行嵌合体胚胎及小鼠的制备实验以验证其体内分化潜能,结果表明:Bdh2基因缺失不影响ASCs的生殖嵴转移能力,仍可以贡献到胎儿组织和卵黄囊,并产生一只存活的嵌合体小鼠。本研究建立的Bdh2基因纯合缺失的胚胎干细胞系ASCs和ESCs将会是研究Bdh2基因在发育过程中作用的一个很好的实验材料,同样对研究干细胞早期命运决定和DNA甲基化也是理想的细胞系。