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目的:大面积或大段骨缺损的修复一直是医学领域研究的热点问题,物理因子刺激骨的生长和修复成为骨缺损治疗的方法之一。低强度脉冲超声波（low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）是一种以高频声压压力波的形式在组织内传播的非侵入性物理疗法,已得到美国食品和药品管理局的批准可在临床上应用,用于治疗新鲜骨折、骨折延迟愈合和骨不连。三维支架材料在针对大面积骨缺损修复的骨组织工程中占据着非常重要的地位,它不仅能起到支撑、保持原有组织形状的作用,而且还起到模板作用,能够为细胞提供赖以寄宿、增殖、分化、生长的场所,从而引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。多孔Ti6Al4V是高强高韧的钛合金支架材料,其多孔结构可以提供骨组织生长的空间,能够为超声波提供传导通道,通过对其孔隙率的调控可以使之与骨组织弹性模量相匹配,其对应力的骨传导可促进骨组织的修复。因此,LIPUS与Ti6Al4V三维支架材料的联合应用成为了大面积骨缺损修复的新思路。细胞迁移是机体正常生长发育的生理过程,成骨细胞及骨髓间充质干细胞的迁移对于骨折及骨缺损处的愈合极其重要。LIPUS能够调节成骨细胞的聚集、迁移以及分化水平,影响相关细胞因子的分泌,从而从不同通路途径促进骨缺损处的愈合;课题组成员前期实验结果证明LIPUS可以促进成骨细胞向多孔Ti6Al4V支架材料内长入,并促进兔下颌骨支架材料内骨组织的长入及骨成熟,又通过对加载及未加载LIPUS的多孔Ti6Al4V支架材料上成骨细胞进行全转录组测序分析发现,LIPUS作用下mmu-mi R-30c-1-3p下调显著,提示mi R-30c-1-3p的下调可能在LIPUS促进成骨细胞向支架材料内长入中发挥作用。为了更好的了解mi R-30c-1-3p的功能,前期通过生物信息学预测分析显示RHOB为mi R-30c-1-3p的靶基因,STAT3为mi R-30c-1-3p的潜在转录调控因子,研究表明RHOB的高表达与成骨细胞迁移相关,而STAT3是细胞迁移及成骨分化的一个重要调控因子,且前期预实验结果显示,LIPUS作用下RHOB高表达,STAT3低表达,因此我们推测LIPUS作用下,表达下调的转录因子STAT3,抑制了mi R-30c-1-3p的转录水平,从而拮抗其负性调控靶基因RHOB的功能,使RHOB的表达升高,从而促进了钛合金多孔材料上成骨细胞的迁移水平及骨组织长入深度。综上所述,本研究拟通过体内外实验证明LIPUS可通过调控STAT3/mi R-30c-1-3p/RHOB轴促进支架材料内成骨细胞迁移及骨组织长入,初步探寻LIPUS促进三维支架材料内成骨细胞迁移及骨组织长入的分子生物学机制,为LIPUS与三维支架材料联合应用修复大面积骨缺损提供理论基础。研究方法:1、将成骨细胞接种在Ti6Al4V支架材料上,随机分为超声组及假辐照的对照组,应用RT-q PCR、Western blot、ELISA实验评估LIPUS对迁移相关指标SDF-1、TGFβ、CXCR4基因及蛋白表达水平的影响;应用细胞划痕、Transwell实验以及激光共聚焦显微镜评估LIPUS对支架材料上成骨细胞迁移水平的影响。2、应用RT-q PCR、Western blot、ELISA实验评估LIPUS对STAT3/mi R-30c-1-3p/RHOB轴中STAT3、mi R-30c-1-3p、RHOB表达水平的影响;分别转染STAT3、mi R-30c-1-3p、RHOB,应用RT-q PCR、Western blot、ELISA实验评估转染STAT3、mi R-30c-1-3p、RHOB对下游迁移相关指标SDF-1、TGFβ、CXCR4基因及蛋白表达水平的影响;应用细胞划痕、Transwell实验以及激光共聚焦显微镜评估转染STAT3、mi R-30c-1-3p、RHOB对支架材料上成骨细胞迁移水平的影响;应用RT-q PCR、Western blot及荧光素酶实验证明STAT3与mi R-30c-1-3p、mi R-30c-1-3p与RHOB的靶向关系;应用回复性实验补充验证LIPUS可通过调控STAT3/mi R-30c-1-3p/RHOB轴促进支架材料内成骨细胞的迁移水平。3、将Ti6Al4V支架材料植入到大鼠下颌骨前牙区,随机分为LIPUS组及假辐照组,并分别定期局部注射mi R-30c-1-3p agomir或PBS,组织学观察骨组织在支架材料内长入及成熟情况;分别提取骨组织的RNA,利用RT-q PCR检测支架材料内骨组织中Stat3、mi R-30c-1-3p、Rhob以及迁移相关基因Sdf-1、Tgfβ、Cxcr4表达水平的改变,从而在体内验证LIPUS与mi R-30c-1-3p对细胞迁移相关指标Sdf-1、Tgfβ、Cxcr4的基因表达水平及支架材料内骨组织长入及成熟的影响。结果:1、RT-q PCR、Western blot、ELISA结果显示,LIPUS促进了Ti6Al4V支架材料上成骨细胞SDF-1、TGFβ、CXCR4的基因及蛋白的表达水平;细胞划痕、Transwell实验以及激光共聚焦显微镜结果显示LIPUS能够促进支架材料上成骨细胞迁移水平。2、RT-q PCR、Western blot结果显示LIPUS能够促进支架材料上成骨细胞中RHOB的表达水平,降低mi R-30c-1-3p、STAT3的表达水平;RT-q PCR、Western blot、ELISA、细胞划痕、Transwell实验以及激光共聚焦显微镜结果显示mi R-30c-1-3p mimics、RHOB si RNA抑制了支架材料上成骨细胞的迁移水平并降低了下游迁移指标SDF-1、TGFβ、CXCR4的表达水平,而STAT3 si RNA促进了支架材料上成骨细胞的迁移水平,并增加了下游迁移指标SDF-1、TGFβ、CXCR4的表达水平;RT-q PCR、Western blot及荧光素酶实验结果显示STAT3为mi R-30c-1-3p的转录因子、mi R-30c-1-3p与RHOB具有靶向结合调控关系;成骨细胞转染后,LIPUS以及回复性实验均能够一定程度上回复单纯转染对STAT3/mi R-30c-1-3p/RHOB轴下游基因及蛋白的表达水平的影响。3、组织学观察结果显示LIPUS能够促进大鼠下颌骨支架材料内骨组织的生成及骨成熟度,而mi R-30c-1-3p agomir能够抑制大鼠下颌骨Ti6Al4V支架材料内骨组织的生成以及骨成熟度,LIPUS能够一定程度上回复mi R-30c-1-3p agomir对骨生成及骨成熟的抑制作用;RT-q PCR结果显示LIPUS能够促进STAT3/mi R-30c-1-3p/RHOB轴上Rhob的基因表达水平,抑制了Stat3、mi R-30c-1-3p的基因表达水平,LIPUS能够促进支架材料骨组织内Sdf-1、Tgfβ和Cxcr4的基因表达水平,而mi R-30c-1-3p agomir抑制了支架材料骨组织内Rhob、Sdf-1、Tgfβ和Cxcr4的基因表达水平,LIPUS能够一定程度上回复mi R-30c-1-3p agomir对骨组织内Rhob、Sdf-1、Tgfβ和Cxcr4的基因表达水平的抑制作用。结论:1、LIPUS能够促进支架材料内成骨细胞的迁移,并促进迁移相关指标SDF-1、TGFβ、CXCR4的表达水平。2、体外实验中,LIPUS能够通过调控STAT3/mi R-30c-1-3p/RHOB轴促进支架材料内成骨细胞的迁移及迁移相关指标SDF-1、TGFβ、CXCR4的表达水平。3、体内实验中,LIPUS可能通过下调mi R-30c-1-3p的表达水平,促进大鼠下颌骨前牙区支架材料内骨组织的长入、成熟及迁移相关指标Sdf-1、Tgfβ、Cxcr4的基因表达水平。