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胆道闭锁(biliary atresia, BA)是以新生儿期肝内外胆管的炎症和纤维化梗阻为特征的疾病,其发病率在活婴中约为1/5000～8000,研究表明本病具有地域和季节差异、高龄产妇、多产、早产均与本病发生有关,男女发病比例为1：1.25。BA是新生儿期胆汁淤积最常见的原因,且是小儿肝移植最常见的指证,儿童肝移植中大约40-50%为胆道闭锁患儿。尽管肝门空肠吻合术(Kasai手术)能够改善部分患儿的肝外胆道梗阻,重建胆汁引流,但大部分患儿仍发生进行性胆汁性肝硬化,且有70%-80%的胆道闭锁患儿最终需接受肝移植手术。如何提高胆道闭锁患儿的长期生存率是困扰小儿外科医师的难题,而明确胆道闭锁的病因和发病机制是提高治疗效果的必要前提。随着研究的深入,目前关于BA的病因,主要学说有感染、免疫、自身免疫、基因学说等,近年的研究发现,病毒感染与BA的发病密切相关,尤其是病毒感染所引发的进行性炎性纤维化病变。轮状病毒、巨细胞病毒、Ⅲ型呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒等均与胆道闭锁的发生相关,其中有关轮状病毒与胆道闭锁的关系最为引人注目。不仅在胆道闭锁患儿的肝脏中检测到了轮状病毒,而且给新生鼠腹腔注射轮状病毒成功制作出了胆道闭锁的动物模型,并且动物模型与人类BA患儿的临床病理特征具有许多相似点,如介导胆管损伤的肝门部炎性细胞因子的种类,肝外胆管损伤的大体形态学变化及发生胆管梗阻的时间依赖性等方面。轮状病毒属于呼肠孤病毒科,由11个双链RNA染色体组成,含6个结构蛋白和6个非结构蛋白,其引起的早期腹泻可能是由于NSP4与整联蛋白受体结合进而导致钙动员并发生氯离子分泌应答,可能机制是由于NSP4从感染细胞向紧邻的非感染细胞进行扩散从而激活特异性的信号通路。轮状病毒NSP4(non structural protein4,NSP4)是由第10位基因编码的初始产物并由175个氨基酸组成的跨内质网膜糖蛋白,是最先被发现的病毒肠毒素,其对病毒的形态发生、复制及致病机理具有重要作用,有研究表明应用siRNA技术沉默NSP4后将引起病毒蛋白质的异常分布,感染性病毒颗粒的减少及空病毒颗粒的增加。研究证实,在轮状病毒引起的肠道损伤中,NSP4是主要的肠毒素,且轮状病毒感染后外周血中CD8+淋巴细胞数量显著增高。CD8+淋巴细胞是重要的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL),也是细胞免疫主要的效应细胞,在机体抗感染免疫和抗肿瘤免疫中起着重要的作用。如果用抗体清除CD8+淋巴细胞,NSP4则不会导致小鼠肠道上皮的损伤。在众多的免疫细胞中,CD8+淋巴细胞激活在轮状病毒致新生鼠胆道闭锁的形成中起重要作用。研究表明,轮状病毒感染机体后,轮状病毒的部分抗原被组织中的巨噬细胞吞噬并且将抗原递呈至CD4+淋巴细胞,从而激活CD8+淋巴细胞,并分泌穿孔素等因子攻击胆管上皮细胞,造成胆管上皮细胞破坏,并导致被破坏的胆管上皮细胞被巨噬细胞吞噬而将自身抗原递呈至免疫系统,从而造成进一步的损伤。研究发现用CD4+淋巴细胞抗体清除新生鼠的CD4+淋巴细胞,新生鼠在轮状病毒感染后仍可发生胆道闭锁,但用CD8+淋巴细胞抗体清除CD8+淋巴细胞,新生鼠在感染轮状病毒后并不发生胆道闭锁,说明CD8+淋巴细胞激活在轮状病毒致新生鼠胆道闭锁的形成中起重要作用。CTL抗原决定簇又称CTL表位(CTL epitope),对于免疫疫苗的设计具有重要作用。以前的研究表明,只有抗原中的CTL表位才引起有效的CTL免疫应答,CTL表位是蛋白抗原经抗原递呈细胞加工处理,继而与MHC Ⅰ类分子结合并最终递呈给T细胞受体识别,引起有效免疫应答的短肽,又称表位肽。虽然有关轮状病毒VP6与VP7的CTL表位已有报道,但目前未见NSP4特异性CTL表位的研究报告。由此我们推测,轮状病毒引起胆道闭锁可能与轮状病毒致肠道损伤一样是由NSP4激活CD8+淋巴细胞引起的,NSP4及其CTL表位激活了CD8+淋巴细胞,后者对胆管上皮细胞发生特异性的杀伤作用,从而导致胆管上皮细胞损伤。本课题拟对NSP4及其CTL表位激活CD8+淋巴细胞、继而形成对胆管上皮细胞的特异性杀伤作用进行研究,从而弄清NSP4导致胆管上皮细胞损伤的机理,为免疫干预降低胆道闭锁的发生率及改善胆道闭锁的预后提供一定的理论依据。如果能找到NSP4的CTL表位并有针对性地研制疫苗或抗体,将有望达到预防或控制轮状病毒感染的目的而克服轮状病毒或NSP4疫苗的致病性,从而为通过免疫干预降低胆道闭锁的发生或改善胆道闭锁的预后奠定基础。第一部分整联蛋白α2β1在轮状病毒致肝外胆管上皮细胞损伤中的作用目的：检测肝外胆管上皮细胞整联蛋白的表达类型并进一步探讨其在轮状病毒致肝外胆管上皮细胞损伤中的作用。方法：取Balb/c小鼠的肝外胆管进行肝外胆管上皮细胞培养至第三天,用直接免疫荧光法检测整联蛋白α2、β1亚基,用间接免疫荧光法检测α4亚基。用透射电镜观察轮状病毒与肝外胆管上皮细胞的结合。然后加入相应的整联蛋白抗体,再加入轮状病毒,观察各组引起的细胞病变(Cytopathic effect, CPE),并进行统计学分析。结果：用直接免疫荧光法检测到了整联蛋白α2、β1亚基存在于肝外胆管上皮细胞膜表面,用间接免疫荧光法检测到了α4亚基存在于肝外胆管上皮细胞膜表面。同时透射电镜观察到了轮状病毒与肝外胆管上皮细胞的结合。加入相应抗体阻断整联蛋白α2β1和α4β1后,CPE较对照组明显减轻,而且CPE在阻断α2β1组较阻断α4β1组减轻更为明显。结论：肝外胆管上皮细胞表面表达整联蛋白α2、β1和α4亚基并且整联蛋白α2亚基的含量可能大于α4亚基的含量,整联蛋白α2β1可以介导轮状病毒感染肝外胆管上皮细胞从而引起细胞损伤。第二部分轮状病毒NSP4与整联蛋白α2β1在肝外胆管上皮细胞损伤中的作用目的：探讨轮状病毒NSP4与整联蛋白α2β1在肝外胆管上皮细胞损伤中的作用。方法：取Balb/c小鼠的肝外胆管进行肝外胆管上皮细胞培养至第3天,用激光共聚焦方法检测整联蛋白α2、β1亚基及轮状病毒NSP4。用siRNA干扰技术沉默培养至第3天的肝外胆管上皮细胞的整联蛋白α2后加入轮状病毒,用Real Time RT-PCR方法检测α2亚基及轮状病毒NSP4的messenger RNA(mRNA)含量,并进行统计学分析。结果：用激光共聚焦方法检测到了整联蛋白α2、β1亚基存在于肝外胆管上皮细胞表面；轮状病毒NSP4和整联蛋白α2亚基从感染细胞向紧邻的非感染细胞进行扩散；siRNA干扰技术表明沉默整联蛋白α2后轮状病毒NSP4messenger RNA(mRNA)含量较对照组减低(P<0.05)。结论：肝外胆管上皮细胞表面表达整联蛋白α2、β1且整联蛋白α2β1是轮状病毒NSP4的受体并进一步导致肝外胆管上皮细胞损伤。第三部分轮状病毒NSP4介导的免疫反应在胆道闭锁鼠模型损伤中的作用目的：探讨表达纯化的轮状病毒NSP4介导的免疫反应在胆道闭锁鼠模型损伤中的作用。方法：对出生后24小时内的新生鼠腹腔注射表达纯化的轮状病毒NSP4,分别于腹腔注射后7、14天用胞内细胞因子染色法检测肝脏CD8+淋巴细胞释放的IFN-Y,用乳酸脱氢酶释放法检测CD8+淋巴细胞对培养的肝外胆管上皮细胞(感染RRV与未感染RRV组)的杀伤程度,酶联免疫斑点法检测肝脏淋巴细胞释放的IFN-γ,用ELISA法检测小鼠外周血清IFN-γ的含量,并研究剔除CD8+淋巴细胞后肝脏淋巴细胞及外周血清释放IFN-γ的情况及肝外胆管的损伤程度。结果：胞内细胞因子染色结果表明NSP4免疫后肝脏CD8+淋巴细胞释放的IFN-γ含量大于对照组(P<0.05)；细胞杀伤实验结果表明NSP4免疫后肝脏CD8+淋巴细胞对肝外胆管上皮细的杀伤效应明显强于对照组(P<0.05),且对感染了RRV的肝外胆管上皮细胞的杀伤效应强于未感染RRV组；酶联免疫斑点结果表明肝脏淋巴细胞释放的IFN-γ含量大于对照组(P<0.05)；外周血清ELISA检测结果表明IFN-γ释放量大于对照组(P<0.05)；剔除CD8+T淋巴细胞后肝脏淋巴细胞及外周血清释放的IFN-γ含量明显降低(P<0.05)并且肝外胆管的损伤程度较阻断前明显减轻。结论：轮状病毒NSP4介导的CD8+淋巴细胞引起的免疫反应在肝外胆管的损伤中具有重要作用。第四部分轮状病毒NSP4表位肽的预测与研究目的：研究并明确轮状病毒NSP4的CTL表位肽。方法：运用生物信息学方法预测并固相多肽合成轮状病毒NSP4的CTL表位肽,对出生后24小时内的新生鼠腹腔注射合成的NSP4表位肽及激动剂,分别于腹腔注射后7、14天用胞内细胞因子染色法检测肝脏CD8+淋巴细胞释放的IFN-γ,用乳酸脱氢酶释放法检测CD8+淋巴细胞对培养的肝外胆管上皮细胞(感染RRV与未感染RRV组)的杀伤程度,酶联免疫斑点法检测肝脏淋巴细胞释放的IFN-γ,用ELISA法检测小鼠外周血清IFN-γ的含量。结果：胞内细胞因子染色结果表明NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组肝脏CD8+释放的IFN-γ明显增多(P<0.05)；细胞杀伤实验结果表明NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组肝脏CD8+对肝外胆管上皮细胞的杀伤效应明显强于NSP424-32和NSP493-110组(P<0.05),且对感染了RRV的肝外胆管上皮细胞的杀伤效应强于未感染RRV组；酶联免疫斑点结果表明NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组肝脏淋巴细胞释放的IFN-γ明显增多(P<0.05)；外周血清ELISA检测结果表明NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组释放的IFN-γ明显增多(P<0.05)。结论；NSP4157-170和NSP4144-152可能是轮状病毒NSP4的CTL表位肽。