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研究背景卵巢癌(ovarian cancer)死亡率位居妇科恶性肿瘤之首。由于早期临床表现非特异,3/4卵巢癌患者确诊时已处于肿瘤晚期。初次肿瘤细胞减灭术,辅以术后紫杉醇(paclitaxel,PTX)/卡铂联合化疗是晚期卵巢癌的标准治疗方案。然而,大部分患者将最终出现肿瘤的复发,并伴随出现对紫杉醇及其他化疗药物的耐药,即出现多药耐药(multidrug resistance,MDR)。多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)及其编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)过表达是卵巢癌耐药的主要原因之一。MDR卵巢癌细胞系和临床肿瘤标本均可检测到MDR1/Pgp的过表达。肿瘤耐药是卵巢癌化疗失败的主要原因,也是科研和临床工作者需要攻克的难题之一。防止药物敏感性卵巢癌产生耐药和逆转耐药卵巢癌的耐药性均有望攻克卵巢癌耐药。研究已证实,多种药物可以防止肿瘤细胞在化疗过程中产生耐药,如:Pgp抑制剂伐司扑达(Valspodar,PSC833)、比立考达(Biricodar,VX-710)和Tariquidar(XR9576)等。但是,临床试验结果显示其并不能明显改善肿瘤患者生存率。因此,我们有必要发现更高效和特异的药物,以有效防止肿瘤产生耐药。NSC23925是一种甲氧基苯基哌啶基小分子化合物,最近被证实为是一种选择性、高效性的Pgp抑制剂。NSC23925通过高选择性调节Pgp ATPase的活性,有效逆转MDR卵巢癌体外培养细胞和裸鼠移植瘤模型对紫杉醇的耐受性。然而,NSC23925能否有效防止药物敏感性卵巢癌细胞在紫杉醇处理过程中产生耐药还未知。MDR1小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)通过降低MDR1和Pgp的表达有望逆转卵巢癌耐药。然而,目前在体内将si RNA靶向、系统、高效和安全运输至特定细胞仍存在很多障碍。近年来,纳米因其独特的物理和生物学特性成为si RNA运输载体领域研究的热点。低分子量透明质酸(Hyaluronic acid,HA)具有生物相容性、生物可降解性、非免疫原性、无毒性、可化学修饰性,且可与耐药卵巢癌细胞表面过表达的CD44(Cluster of differentiation 44)结合,因此HA作为本课题纳米载体的主要组成部分。研究已证实CD44靶向的HA为基础的纳米可将化疗药物或si RNA转运至细胞内。然而,透明质酸-聚乙烯亚胺/透明质酸-聚乙二醇(HA-poly(ethyleneimine)/HA-poly(ethylene glycol),HA-PEI/HA-PEG)纳米能否成功转运MDR1 si RNA并逆转卵巢癌耐药还未知。因此,本课题将分为三个部分探讨上述问题。第一部分NSC23925防止体外培养的药物敏感性卵巢癌细胞产生多药耐药的研究目的验证NSC23925能否防止体外培养的药物敏感性卵巢癌细胞在紫杉醇处理过程中产生MDR,并探讨其潜在的分子机制。材料和方法为了建立MDR卵巢癌细胞系,分别给予药物敏感性卵巢癌细胞,OVCAR8和SKOV-3,浓度递增的紫杉醇、浓度递增的紫杉醇联合NSC23925(紫杉醇/NSC23925)和NSC23925处理。选取不同紫杉醇处理浓度下的子代细胞系,采用MTT、Real-time PCR、蛋白印迹(Western blot)、细胞免疫荧光(immunoflunence,IF)、药物摄取/泵出(drug uptake/efflux)实验分别检测子代细胞对化疗药物的敏感性、MDR1的表达水平及Pgp的表达水平和活性。结果1.NSC23925可以防止药物敏感性卵巢癌细胞在紫杉醇处理过程中出现多药耐药。(1)紫杉醇单独处理的OVCAR8和SKOV-3细胞最终可以在含有0.3μM紫杉醇的培养基中稳定生长(子代细胞系标记为OVCAR8/paclitaxel0.3和SKOV-3/paclitaxel0.3),而紫杉醇/NSC23925处理的OVCAR8和SKOV-3细胞最终分别只能在含有0.006和0.001μM紫杉醇的培养基中稳定生长(子代细胞系标记为OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925和SKOV-3/paclitaxel0.001-NSC23925)。(2)与亲代细胞相比,OVCAR8/paclitaxel0.3和SKOV-3/paclitaxel0.3细胞对紫杉醇的敏感性显著降低;而OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925和SKOV-3/paclitaxel0.001-NSC23925细胞始终保持对紫杉醇的敏感性。(3)与亲代细胞相比,OVCAR8/paclitaxel0.3细胞对多柔比星、长春新碱和多西紫杉醇的敏感性显著降低,而OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925细胞保持对上述化疗药物的敏感性。2.NSC23925通过阻止紫杉醇处理过程中Pgp和MDR1的过表达,从而防止药物敏感性卵巢癌细胞产生MDR。与紫杉醇/NSC23925处理的细胞相比,紫杉醇单独处理的细胞最终Pgp和MDR1的表达水平显著升高。3.在紫杉醇处理过程中,联合使用NSC23925可以通过调节Pgp的活性,保持药物在细胞内的蓄积水平,从而维持卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。与OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925相比,OVCAR8/paclitaxel0.3细胞内Calcein AM、Rhodamine(R123)、多柔比星和Dioc2的蓄积量明显减少,R123的泵出量明显增多。4.NSC23925单独长期处理卵巢癌细胞,对其化疗药物敏感性、Pgp的表达和活性无明显影响。小结在紫杉醇处理过程中,NSC23925可通过特异性阻止药物敏感性卵巢癌细胞Pgp和MDR1的过表达,并保持Pgp的活性,防止其产生MDR。第二部分NSC23925防止药物敏感性卵巢癌裸鼠模型产生紫杉醇耐药的研究目的目的验证NSC23925能否防止药物敏感性卵巢癌裸鼠模型在紫杉醇处理过程中产生紫杉醇耐药,并探讨其潜在的分子机制。材料与方法所涉及动物实验通过麻省总医院相关部门审批(实验号为:2013N000121)。向3-4周的雌性裸鼠背部皮下注射大约2×106个SKOV-3细胞,首先建立药物敏感性卵巢癌裸鼠模型。然后分别给予裸鼠长周期的紫杉醇或紫杉醇/NSC23925联合治疗,以进一步建立紫杉醇耐药的卵巢癌裸鼠模型。治疗过程中检测裸鼠健康状态、体重和肿瘤体积。实验结束时收集裸鼠肿瘤标本、外周血和肝肾脾。通过Western blot实验评估裸鼠肿瘤Pgp和凋亡相关蛋白的表达水平。通过裸鼠体量变化、白细胞计数、红细胞计数和肝肾脾的组织学形态,评估紫杉醇/NSC23925联合治疗对裸鼠的安全性。结果1.建立紫杉醇耐药的卵巢癌裸鼠模型的最适紫杉醇浓度为25 mg/kg。2.NSC23925通过抑制Pgp过表达,阻止药物敏感性卵巢癌裸鼠模型产生紫杉醇耐药。(1)与临床现象相似,紫杉醇单独处理组在治疗起始阶段无肿瘤体积的增加,但是最终出现肿瘤体积显著增加;而紫杉醇/NSC23925联合治疗组裸鼠在整个治疗过程中肿瘤体积无明显变化,即裸鼠始终保持对紫杉醇的敏感性,无紫杉醇耐药的产生。(2)大多数紫杉醇处理的肿瘤Pgp表达水平升高,而所有紫杉醇/NSC23925联合治疗的肿瘤无Pgp的过表达;紫杉醇/NSC23925联合治疗组肿瘤的Pgp表达水平显著低于紫杉醇单独治疗组(P<0.01)。3.紫杉醇/NSC23925联合治疗促进裸鼠肿瘤细胞的凋亡。紫杉醇/NSC23925治疗组肿瘤的抗凋亡蛋白survivin(P<0.001),Bcl-x L(P<0.05)和MCL-1(P<0.01)的表达水平显著低于紫杉醇单独治疗组,CD44(P<0.05)和Integrinβ3(P<0.01)的表达水平也显著低于紫杉醇单独组。4.长周期的NSC23925单独治疗,或紫杉醇/NSC23925联合治疗对裸鼠无明显的毒副作用。在整个治疗周期中,不同治疗组的裸鼠体重、白细胞计数、红细胞计数和肝肾脾的组织学形态无明显差异。 小结NSC23925通过抑制Pgp和抗凋亡蛋白的表达水平,防止药物敏感性卵巢癌裸鼠模型产生紫杉醇耐药。第三部分装载MDR1 si RNA的CD44靶向的HA-PEI/HA-PEG纳米逆转卵巢癌耐药的研究目的在耐药卵巢癌体内外模型中验证CD44靶向的透明质酸-聚乙烯亚胺/透明质酸-聚乙二醇(HA-poly(ethyleneimine)/HA-poly(ethylene glycol),HA-PEI/HA-PEG)纳米能否成功转运MDR1 si RNA,并评估其对MDR1和Pgp表达水平的抑制作用和对肿瘤耐药的逆转作用。材料与方法我们首先合成并鉴定HA-PEI/HA-PEG纳米,之后通过Real-time PCR、Western blot、MTT等实验评估HA-PEI/HA-PEG/MDR1 si RNA纳米对体外培养的耐药卵巢癌细胞MDR1和Pgp表达水平,和紫杉醇敏感性的影响。另外,采用紫杉醇联合HA-PEI/HA-PEG/MDR1 si RNA纳米治疗耐药卵巢癌裸鼠模型,检测其对裸鼠肿瘤体积、Pgp表达水平和凋亡水平的影响。结果1.耐药卵巢癌细胞系OVCAR8TR和SKOV-3TR,以及卵巢癌肿瘤标本中CD44高表达。2.HA-PEI/HA-PEG/MDR1 si RNA纳米的平均粒径为173.3±13.7 nm,zeta电位为-22.5±0.44 m V,且在研究所需浓度下对卵巢癌细胞无明显毒性。3.HA-PEI/HA-PEG成功将MDR1 si RNA转运至卵巢癌细胞内,并降低细胞MDR1和Pgp的表达水平,增加化疗药物在细胞内的蓄积水平,恢复耐药细胞对紫杉醇的敏感性。4.与对照组相比,紫杉醇联合HA-PEI/HA-PEG/MDR1 si RNA纳米治疗显著抑制耐药卵巢癌裸鼠肿瘤体积的生长,并降低肿瘤Pgp表达水平,促进肿瘤凋亡。小结CD44靶向的HA-PEI/HA-PEG纳米可成功将MDR1 si RNA转载至耐药卵巢癌细胞,并显著下调MDR1和Pgp的表达水平,促进裸鼠肿瘤细胞凋亡,从而逆转卵巢癌耐药。结论1.NSC23925可以防止药物敏感性卵巢癌细胞在紫杉醇处理过程中产生耐药。卵巢癌患者首次化疗时,联合应用NSC23925有望防止Pgp介导的耐药的产生,从而改善其临床结局。2.CD44靶向的HA-PEI/HA-PEG/MDR1 si RNA纳米颗粒可以有效逆转卵巢癌耐药,有望改善卵巢癌患者的临床预后。