天门冬酰胺酶(asparaginase)别称天冬酰胺酶、门冬酰胺酶等,它的主要功能是水解天门冬酰胺为天门冬氨酸与氨,在动物、微生物、植物组织中广泛存在。动物体内的天门冬酰胺酶主要存在于哺乳动物和鸟类的肝、胰、肾、胃和脾中。黑曲霉中的天门冬酰胺酶有两种状态：一种是褐色或浅黄色的液体,一种是淡或深黄色的粉末。能溶于水,但在氯仿、丙酮等有机溶剂中不溶。贮存在水溶液20℃、7天或5℃、14天酶均有活性。黑曲霉CICC2462作为本实验的受体菌,该菌株具有的优势：高表达的蛋白能力、及强的分泌能力、较低的胞外蛋白酶活性、对筛选标记潮霉素及其的敏感。通过基因置换技术把目的基因定点整合到内源高表达的糖化酶基因(glaA)位点,该位点是转录的活跃区,基因调控简单,通过基因置换技术可以消除内源高表达糖化酶基因对外源基因的竞争效应,可实现外源基因的高效表达、工程菌的发酵条件可以进一步得到简化。构建黑曲霉表达载体pSZHG-Asp,采用农杆菌介导黑曲霉遗传转化,该方法具有转化效率高、同源重组率高、遗传稳定性好等特点。利用hph基因表达框两侧的序列,在后续实验中进一步删除潮霉素筛选标记基因,获得食品级天门冬酰胺酶工程菌。此研究思路为国内构建天门冬酰胺酶工程菌提供了新的途径,为高效安全生产酶制剂提供了新的表达系统。主要的研究结果如下：1.天门冬酰胺酶基因的克隆采用CTAB法提取黑曲霉基因组,从提取的基因组中PCR克隆得到天门冬酰胺酶基因,克隆到T-载体,测序正确。2.天门冬酰胺酶基因表达载体的构建将测序正确T-Asp载体、pSZHG载体用相同的酶进行酶切,然后进行连接,构建天门冬酰胺酶表达载体pSZHG-Asp。3.根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化采用农杆菌介导法对黑曲霉进行遗传转化,通过菌落PCR进行筛选,阳性转化率为56.14%。然后农杆菌转化子与黑曲霉共培养,提取的基因组DNA,利用P3、P4引物进行PCR检测,筛选阳性转化子,得到的阳性转化率为30.16%。用P5、P6引物对鉴定正确的转化子进行PCR验证,对是否是同源重组转化子进行鉴定,得到同源重组转化子率为92.45%。将其中4个菌株在含一定浓度的hphB的土豆液体或固体培养基中连续培养、然后进行筛选鉴定,分别用P3、P4,P5、P6引物对20个菌落做PCR鉴定,结果表明3个菌落为纯合的同源重组菌株。4.天门冬酰胺酶在黑曲霉中的表达用发酵培养基对天门冬酰胺酶进行发酵,利用Berthelot显色反应测定天门冬酰胺酶的酶活,发酵时间为21天酶活达到20000U。通过SDS-PAGE电泳,在约40kD处有目的蛋白带,由此知,天门冬酰胺酶在黑曲霉中已得到分泌表达。重组菌株的目的蛋白表达量为185μg/mL～417μg/mL。