三七为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根,是著名的传统中药,具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效。现代化学和药理学研究表明三七中皂苷类成分在免疫系统、血液系统、心脑血管系统、神经系统、物质代谢以及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好的活性,是三七的主要生物活性物质。本课题测定了从三七中分离得到的8个皂苷人参皂苷Rb₁（ginsenoside Rb₁）、人参皂苷Re（ginsenoside Re）、人参皂苷Rd（ginsenoside Rd）、人参皂苷Rg₁（ginsenoside Rg₁）、人参皂苷Rh₁(ginsenoside Rh₁、三七皂苷K（notoginsenoside K）、三七皂苷R₁（notoginsenoside R₁）和三七皂苷R₄（notoginsenoside R₄）对体外培养人宫颈癌HeLa细胞（Human cervical cancer HeLa cell,HeLa）和人结直肠癌COLO 205细胞（Human colorectal carcinoma COLO 205 cell,COLO 205）的抑制率,并对体外活性最显著的人参皂苷Rd抑制HeLa细胞增殖及诱导凋亡的作用机制进行探讨。测定三七中11个皂苷化合物的溶血性,观察这些皂苷对OVA受免小鼠细胞免疫和体液免疫应答的影响,探讨了溶血性、佐剂活性与化学结构之间的构效关系。MTT法测定Rd体外对刺激原诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响,RT-PCR方法分析Rd对小鼠脾细胞IL-2、IL-4、IL-10以及INF-γ基因表达的影响,流式细胞术检测以Rd为佐剂的OVA受免小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-5、INF-γ和TNF-α等细胞因子的水平,以及血液中T淋巴细胞亚群CD4⁺和CD8⁺细胞比例,初步研究了Rd的免疫佐剂活性作用机理。 1.三七中人参皂苷Rd对HeLa细胞增殖抑制及凋亡诱导作用 MTT法分析结果表明:Rb₁、Re、Rg₁、Rh₁、Rd、K、R₁和R₄对体外培养的HeLa细胞和COLO 205细胞增殖均有一定程度的抑制作用,其中以Rd的活性最显著。Rd对HeLa细胞增殖的抑制作用呈良好的剂量和时间依赖性,作用48小时的IC₅₀值为150.5±0.80μg/ml。考马斯亮蓝法测定经不同浓度Rd处理48小时HeLa细胞中总蛋白含量的结果显示Rd可显著降低HeLa细胞内蛋白质含量,并呈浓度依赖性。 Rd 180μg/ml处理48小时的HeLa细胞,姬姆萨染色后在光学显微镜下可观察到细胞染色质浓缩并靠近核膜,产生核边集、核膜裂解现象;吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察,细胞皱缩、核浓染甚至可见浓染的碎片;电镜下观察处理细胞出现典型的凋亡超微结构变化,表现为细胞体积缩小,表面微绒毛减少或消失,胞浆浓缩,胞浆内空泡增多,细胞核染色质发生边集固缩,在核膜周边聚集形成高电子密度的质块,并