随着人类对电离辐射(ionizing radiation,IR)的认识逐步深入,国防军工、商业、农业、医疗等不同领域对电离辐射的依赖越来越大,但我们要认识到IR对人体的潜在危害。临床上,放射治疗已成为大部分恶性肿瘤患者联合治疗的手段,但是其引起的副作用不仅增加了患者的经济压力,更降低了患者的生活质量,给患者造成了巨大的经济和生理负担。其中,肠道因其具有快速自我更新能力,所以对IR十分敏感。放射性肠损伤(radiation-induced intestinal injury,RIII)是临床盆腔、腹腔和腹膜后肿瘤病人放射治疗的常见并发症,也是核辐射事件中早期核辐射死亡的主要原因。普遍认为RIII由IR的直接和间接效应导致。IR可以直接破坏细胞DNA和蛋白质的结构完整性并抑制其合成,同时产生的大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)也会对细胞造成损伤,并最终导致细胞凋亡。然而目前临床上尚无治疗RIII的特异性药物,因此找到能有效增强肠道辐射防护能力的靶点具有非常重要的临床意义。Ras相关C3肉毒毒素亚基1(Ras-related C3 botulinum toxinsubstrate 1,Rac1)是一种小分子三磷酸鸟苷(Guanosine Triphosphate,GTP)结合蛋白,属于Rho家族的经典成员。Rac1跟很多细胞行为有关,包括凋亡、分化和基因转录等。近年来,许多研究发现,Rac1不仅是NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)(细胞内产生ROS的关键酶)激活的关键成分,同时也是影响细胞周期的重要分子。已知ROS大量升高、细胞周期阻滞,是IR损伤及修复的重要机制,因此,我们推测Rac1可能在肠道IR损伤的调控中发挥重要作用,而这一研究目前国内外尚无相关报道。本课题就针对Rac1与肠道IR损伤间的关系做一研究,通过体内体外实验验证Rac1在其中发挥的作用,并对机制做进一步的探讨。此外,我们还开展了Rac1对肠道肿瘤细胞辐射敏感性的实验研究,从而更全面的评估Rac1分子作为肠道肿瘤放疗损伤治疗靶点的潜在应用价值。我们首先通过小鼠动物实验验证抑制Rac1活性对小鼠RIII的影响。H&E染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)结果显示,照射后对照组小肠隐窝的数量减少,肠道粘膜减少,肠壁因为毛细管扩张和炎症细胞浸润变得拥挤膨胀,而给药组(Rac1抑制剂)小鼠则有明显改善(P<0.01),表现为肠粘膜损伤较少,隐窝数目较多,炎症反应轻。说明照射前抑制Rac1活性能减轻RIII。随后我们检测了小肠凋亡情况,TUNEL染色(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling)和Western Blot实验结果均显示给药组的凋亡比对照组明显降低(P<0.01)。动物实验的结果验证了我们的猜想,即Rac1跟RIII有关,抑制其活性可以保护小肠组织,降低小肠的损伤和肠道上皮细胞的凋亡。在动物水平验证抑制Rac1活性可以保护照射后肠道组织的基础上,我们又用小鼠正常肠道细胞,从细胞水平对Rac1的作用进行更进一步的研究并初步探究其机制。细胞活力实验表明抑制Rac1活性可以增加MODE-K细胞照后的活力(P<0.01),并且也确定了后续实验的合适给药浓度为100μM。流式检测和Western Blot实验结果显示,照射后给药组凋亡率和凋亡相关蛋白表达均比对照组显著降低(P<0.01)。线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)实验结果显示给药组线粒体膜电位明显高于对照组(P<0.01)。以上结果说明抑制Rac1活性可以降低正常小鼠肠道细胞辐射敏感性,抑制照后细胞的线粒体途径凋亡通路激活。临床上肿瘤病人放疗时给予的辐射防护剂,除了可以保护正常组织外,对肿瘤组织也有一定的保护作用。既往大量文献报道,在肿瘤病人中Rac1不是过表达就是活性明显升高,甚至有研究认为Rac1基因是一种原癌基因,所以我们做完正常动物和细胞的相关实验外,我们又检测了抑制Rac1活性对小鼠肠道肿瘤细胞的影响。结果显示,给药组肿瘤细胞的活力显著降低(P<0.01),并且100μM的抑制剂浓度效果最理想,所以我们选定100μM作为后续实验的给药浓度。流式细胞术和Western Blot实验结果显示,照射后给药组凋亡率(P<0.05)和凋亡相关蛋白表达(P<0.01)均比对照组显著升高。线粒体膜电位实验结果显示给药组线粒体膜电位明显高于对照组(P<0.05)。说明抑制Rac1活性可以增加肿瘤细胞的辐射敏感性。该结果与正常细胞的恰好相反,说明抑制Rac1对正常细胞具有辐射保护作用,但又能增加肿瘤细胞的辐射敏感性。在得到上述结果后,我们对抑制Rac1减轻肠道上皮细胞辐射损伤的分子机制开展了进一步的研究,同时还对抑制Rac1在正常细胞与肿瘤细胞间不同效应的原因进行了探究。我们发现:抑制Rac1活性可以降低照射后肠道上皮细胞的ROS水平,同时改变照后细胞周期蛋白Cylin D1、Cyclin B1的表达,延长G1期对损伤DNA进行修复时间,进而缩短了G2/M期,从而减轻了照后细胞周期的阻滞。但对于肠道肿瘤细胞我们发现抑制Rac1活性不能有效降低照射后肿瘤细胞ROS水平,但显著延长了G2/M期阻滞,同时跳过了至关重要的G1期DNA修复,导致整个细胞周期变长和细胞凋亡增加。说明,Rac1对细胞周期及ROS的调节在正常细胞和肿瘤细胞之间具有显著差别,这种差别很可能是Rac1在肿瘤细胞中的突变造成的。为验证这一猜想,我们又对正常肠道上皮细胞和肠道肿瘤细胞的Rac1进行了基因测序,结果发现肿瘤细胞中Rac1确实存在突变。综上所述,我们发现抑制Rac1能有效保护肠道组织和上皮细胞,降低他们对IR的敏感性。同时,抑制Rac1对肿瘤细胞却没有保护作用,还会增加肿瘤细胞的辐射敏感性。以上研究发现对临床肿瘤患者进行放射治疗具有重要意义,也对核事故辐射损伤的防治具有重要参考价值。