论文部分内容阅读
塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）是一种猪的新的外来的病毒,是小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属的典型代表。临床症状与猪口蹄疫（FMD）、猪水疱病（SVD）、猪水疱疹（VES）、猪水疱性口炎（VS）等水泡性疾病非常相似,容易与这些水疱性疾病相混淆、以及误诊,严重危害养猪健康,可以导致很大的经济损失。然而,SVA在致病机理、流行情况、诊断和防控技术等方面研究不多,鉴别技术较少,另外用于研究SVA病原的材料较少。SVA是如何传入中国境内、发生流行、如何遗传进化变异情况等需要深入的研究。因此,本研究开展SVA广东毒株的分离鉴定及其VP1基因的原核表达,具有现实意义。SVA广东毒株的分离鉴定试验。本研究采用三重荧光定量PCR方法,对本实验室于2016-2018年从广东地区多个猪场收集及保存的108份临床样品进行初筛,检测出2份疑似SVA的阳性样品。将2份疑似SVA阳性样品经无菌过滤处理后,接种猪睾丸细胞（ST）,仓鼠肾细胞（BHK-21）进行病毒分离,在第6代传代培养后,48h内能出现典型的细胞病变;连续传代培养后,取细胞培养上清液进行蔗糖密度梯度离心纯化,进行RT-PCR扩增及测序,将测序结提交到NCBI Blastn比对,结果表明两株病毒均为塞内卡病毒,分别命名为SVA CH-GDBL1-2016和SVA CH-GDBL2-2016。将细胞培养上清液作电镜检查,观察到直径约25nm大小的病毒粒子。经TCID50检测,其滴度分别为106.8、106.7。全基因组序列测定与分析比对试验。根据NCBI已登录的SVA序列,设计3对特异性引物,对2株SVA病毒进行全基因组扩增与分析,并利用NCBI Blastn网站、分析软件DNAStar,对病毒的全基因组序列作分析比对。结果表明:两株病毒与国内外分离毒株全基因的同源性在93.8%-99.3%之间。其中与美国分离株ATCC PTA-5343全基因组同源性最低,分别为93.9%、93.8%,与中国分离株CH/GXI09/2016的同源性最高,高达99.3%。而且,分离株SVA CH-GDBL1-2016与分离株SVA CH-GDBL2-2016之间的同源性为99.8%。在系统进化树中,本研究的2病毒株与美国分离株ATCC PTA-5343、SVV-001的亲缘性最远,变异较大,其中,SVV-001为SVA的经典原型;与中国华南地区2016年分离的毒株CH/GXI09/2016亲缘关系最接近。由此可见,本研究所分离鉴定的2株毒株属于Senecavirus病毒属。VP1基因的原核表达试验。为了建立SVA的间接ELISA检测试剂盒,本研究将分离株SVA CH-GDBL1-2016的VP1基因进行原核表达,并成功表达,获得大小约为48KDa的融合蛋白,经SDS-PAGE染色证实该蛋白为VP1蛋白;经Western Blot检测,VP1蛋白具有良好的抗原性。在多方条件的优化下,表达出效果较好的融合蛋白。为后续建立间接ELISA试剂盒,提供原材料。综上所述,本研究分离到Senecavirus病毒属SVA广东毒株2株,同源性分析表明,较美国、哥伦比亚、巴西、泰国的流行株,更接近中国流行株CH/GXI09/2016;成功获得SVA的VP1重组蛋白,有较好抗原性,拟用于建立ELISA诊断方法。为外来新病SVA的诊断、防控研究提供关键材料和奠定了基础。