高产纤维素酶黑曲霉ANSTJ01菌株的分离鉴定与生物学性状探究

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黑曲霉(Aspergillus niger)常见于自然界的土壤、粮食、植物性产品中,具有生长速度快,营养要求低,环境适应性强的特点,能够产生淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸代谢产物,在生产酶制剂、有机酸、异源蛋白等方面应用非常广泛,是一种重要的工业发酵菌种。黑曲霉可以产生高水平的纤维素内切酶和β-葡萄糖苷酶,同时被认为不会产生毒素,是继里氏木霉之后又一种具有工业应用的潜力的纤维素酶产生菌。纤维素酶是一类能够水解纤维素为单糖的复合酶,主要包括纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶。纤维素酶广泛应用于食品、饲料、轻工和生物能源等众多领域。  我们从山东泰安地区生姜上分离到了一株丝状真菌,经过形态学和分子生物学鉴定,鉴定为黑曲霉,命名为黑曲霉ANSTJ01。以黑曲霉模式菌株2485为对照,对ANSTJ01菌株的生物学特性进行了研究,包括菌落形态、生长特性和产酶特性。菌株培养结果表明,ANSTJ01菌株在PDA平板上能够产生整齐茂盛的絮状菌丝,培养36 h有孢子产生,菌落颜色深黑色,培养至120 h菌落背面为深黄色,120 h之后变为白色。ANSTJ01菌株在PDA液体培养基中生长48 h产生孢子,比黑曲霉2485菌株产孢时间晚12 h , ANSTJ01菌株生长速度比2485菌株快,最适生长温度为30 ℃,最适生长pH为3-10。以羧甲基纤维素钠溶液、微晶纤维素悬液、水杨苷溶液、滤纸、可溶性淀粉溶液、果胶溶液、木聚糖溶液、酪蛋白溶液、棕榈酸对硝基苯酯溶液作为底物,分别测定了ANSTJ01菌株和2485菌株固体发酵条件下粗酶液中的纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶(纤维素总酶活)、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、脂肪酶活性。酶活性试验结果表明ANSTJ01菌株能够产生高活性的β-葡萄糖苷酶、淀粉酶,分别达到了4 U/g和2 U/g,纤维素外切酶活性最低,只有0.01 U/g, ANSTJ01菌株产生的纤维素内切酶、纤维素外切酶、滤纸酶、果胶酶活性显著高于2485菌株的酶活性。  为了探究ANSTJ01菌株粗酶液纤维素酶活性较高的原因,使用qRT-PCR方法对纤维素内切酶基因(eglA、eglB)、纤维素外切酶基因(cbhA、cbhB)、β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)、纤维素酶转录调控基因(XlnR)、碳源代谢阻碍基因(CreA)、组蛋白乙酰转移酶基因(Gcn5)的表达水平进行了测定。qRT-PCR试验结果表明,ANSTJ01菌株的XlnR基因表达水平是2485菌株的7倍左右,eglA基因的表达水平是2485的6倍左右, cbhA的表达水平是2485的8倍左右,Gcn5基因和cbhB基因的表达水平则只有2485菌株的1/5,其余纤维素酶相关基因的表达水平没有显著差别。对纤维素内切酶、纤维素外切酶的酶特性进行了测定,结果表明 ANSTJ1菌株和2485菌株的酶特性相似,纤维素内切酶和纤维素外切酶的最适温度为50 ℃,最适pH为弱酸性。对纤维素内切酶基因eglA和纤维素外切酶基因cbhA进行了克隆和测序,对氨基酸序列进行了比较和分析,结果表明eglA的蛋白序列有一个氨基酸不同,突变位置位于信号肽;cbhA的蛋白序列有两个氨基酸的差异,突变位点不位于纤维素外切酶的活性中心。总的来说, ANSTJ01菌株纤维素酶在XlnR因子的调控下产量显著升高是造成发酵液纤维素酶活性显著高于2485菌株的原因。  本研究对ANSTJ01菌株固体发酵生产纤维素酶的发酵条件进行了优化,优化条件包括发酵培养基的基本构成、培养基的含水量、培养基诱导物种类、培养时间、培养温度、培养pH。优化实验结果表明,固体发酵条件的优化能够有效提高纤维素酶产量,当培养基的基本构成物麦麸与麦杆粉比例为3:2-4:1,培养基含水量为75%-80%,培养温度为30 ℃,培养时间为3 d,培养基pH为5时,能够---使ANSTJ01菌株产生最高水平的纤维素酶。
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