猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3,PCV3）属于圆环病毒科圆环病毒属单股环状DNA病毒。自2016年美国科研人员首次鉴定以来,随后在欧洲、亚洲等多个国家不同地区猪群出现PCV3感染情况,其临床表现有猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、心肌炎、仔猪腹泻、母猪繁殖障碍、流产和多系统疾病等,给世界养猪业带来新的威胁。目前临床上缺乏PCV3的特异性快速诊断试剂,解析PCV3 Cap蛋白的特异性抗原表位将为研发PCV3特异性检测试剂奠定基础。此外,临床一线人员亟需一种操作简单的快速检测方法。本研究基于猪圆环病毒的生物学特性、基因结构特征等制备PCV3 Cap特异性单克隆抗体,解析PCV3 Cap蛋白的抗原特性,鉴定其B细胞抗原表位,并建立了用于PCV3检测的重组聚合酶扩增方法（Recombinase polymerase amplification,RPA）。本研究将人工合成的切除核定位信号序列的PCV3 r Cap基因克隆至原核表达载体p ET-32a中,成功构建重组质粒p ET-32a-PCV3-r Cap,进而导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。诱导表达后SDS-PAGE分析,发现PCV3重组Cap蛋白以包涵体形式表达,经优化表达条件,在37℃经1 mmol/L IPTG终浓度诱导4 h可获得充分表达。采用Ni+蛋白纯化柱纯化,最终获得纯化的PCV3 Cap融合蛋白（约为35 k Da）。以纯化的PCV3 Cap蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤细胞融合、间接ELISA筛选、亚克隆成功获得了两株可稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞（B10D、C2B）。IFA试验和Western-blot试验结果表明B10D及C2B单克隆抗体均可以与PCV3 Cap融合蛋白发生免疫反应,单抗亚型分析结果表明B10D抗体为重链Ig G1型,而C2B抗体为重链Ig G2a型,所有轻链为K链。用PCV1和PCV2 Cap蛋白验证抗体特异性试验,证实B10D及C2B单克隆抗体仅与PCV3 Cap蛋白发生特异性免疫反应,不发生交叉反应。此外,效价分析结果显示B10D抗体效价为1:204800,C2B抗体效价为1:409600。以上结果表明,PCV3 Cap重组蛋白具有良好的免疫原性,以及产生的2株单抗克隆抗体均具有免疫活性。本研究采用抗原表位理论预测分析法和多肽扫描技术,利用以上获得的2株PCV3单克隆抗体,对PCV3 Cap蛋白B细胞抗原表位进行鉴定。首先使用软件预测Cap蛋白B细胞抗原表位,再综合预测结果根据整段氨基酸序列设计并合成20条氨基酸有互相重叠的长度为16个氨基酸残基的多肽。将20条多肽作为包被抗原与单克隆抗体反应,结果显示初步鉴定出两个线性抗原表位,单抗B10D识别多肽Cap47NVISVGTPQNNKPWHA62,单抗C2B识别多肽Cap141HSRYFTPKPLLAGTTS156;多肽小鼠免疫试验反向验证结果表明,仅有多肽Cap47～62可以诱导机体产生与PCV3 Cap发生免疫反应的抗体。再利用该方法对已经鉴定的多肽表位Cap47～62进一步的截短表达,最后确定单抗B10D所识别的核心表位为Cap55QNNKPW60。此外,本研究建立了PCV3重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法。根据Gen Bank中多条PCV3基因序列,针对Cap基因保守区域设计三组基础RPA引物,对前期反应条件进行优化和特异性试验,通过经典PCR检测方法与RPA检测方法进行灵敏度比对,并对临床样品进行检测。结果表明,本方法最佳反应条件为39℃恒温扩增20min。该方法敏感性最低可检测到4.56×10~2拷贝/μL,与经典PCR方法灵敏度一致;特异性试验中与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪塞内卡病毒无交叉反应。检测35份临床样品的结果显示,16份阳性样品,阳性检出率为45.71%,与PCR检出率一致,表明该检测方法具有一定的诊断应用价值。综上所述,本研究制备了PCV3 Cap蛋白特异性单克隆抗体,利用合成短肽的方法初步筛选出2个PCV3 Cap蛋白的B细胞抗原表位,进一步鉴定出1个B细胞核心抗原表位Cap55QNNKPW60。另本研究基于PCV3 Cap基因序列,建立了PCV3 RPA检测方法,为后续PCV3的早期感染诊断提供一定的技术支持。